Kỹ thuật nhân giống lan Hồ Điệp

Nhân giống bằng hạt

Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là một phương pháp nhân giống lan thường dùng, cây lan mọc từ hạt được gọi là cây thực sinh. Lan Hồ Điệp phải thông qua thụ phấn nhân tạo mới có thể thu được hạt. Hạt của nó phát triển không hoàn toàn, không có nội nhũ, mà chỉ có một lớp vỏ rất mỏng, gieo hạt trong điều kiện tự nhiên rất khó thu được cây hoàn chỉnh. Năm 1922, Knudson của Mỹ lần đầu tiên phát minh ra phương pháp gieo hạt trong điều kiện vô trùng và có thể thu được một số lượng lớn các cây lan hoàn chỉnh thông qua nuôi cấy mô tế bào, sự thành công này đã thúc đẩy quá trình chọn giống lan cũng như việc sản xuất cây giống và trồng cây lan theo mô hình công nghiệp. Gieo hạt trong điều kiện vô trùng, hạt sẽ nảy mầm theo 1 trong 2 phương thức sau:

Dạng thứ nhất là mọc qua thể tiền chồi (Protocom): khi hạt mới nảy mầm đều hình thành nên thể tiền chồi hình cầu màu trắng, kích thước của thể tiền chồi lớn dần lên, trên bề mặt sẽ xuất hiện rễ giả dạng lông hút, tiếp đó thể tiền chồi sẽ dần chuyển sang màu xanh lục, nhưng thể tiền chồi không mọc dài ra thêm, mà trên đầu chóp của thể tiền chồi sẽ nảy mầm mọc ra chồi, thông thường các thể tiền chồi này đều có khả năng phân hoá ra cây.

Dạng nảy mầm thứ hai là mọc qua thân rễ: khi hạt nảy mầm, ban đầu cũng là thể hình cầu màu trắng, nhưng sẽ mọc dài ra rất nhanh tạo thành một dạng hình trụ dài, rồi hình thành nên thân rễ. Sau đó trên các kẽ của bề mặt thân rẽ mọc ra các rễ giả dạng lông mao, trên môi trường phân hoá, đỉnh chồi của thân rễ sẽ mọc ra cây non, nhưng tỷ lệ phân hoá ra cây là rất thấp, các giống lan địa sinh đều nảy mầm theo phương thức này. Gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo

Lan Hồ Điệp sau khi hoa nở 4 – 6 ngày tiến hành thụ phấn thì tỷ lệ thụ phấn thành công là cao nhất. Lúc thụ phấn điều kiện nhiệt độ, ánh sáng của môi trường có ánh hưởng rất lớn đến tỷ lệ thành công khi thụ phấn. Hạt phấn dùng để thụ phấn phải có màu vàng tươi, kết dính tốt, tách rời nhau mà không dính kết với nhau. Tốt nhất nên thu hạt phấn của hoa mới nở để thụ phấn. Nếu bao phấn có màu vàng đậm hoặc màu vàng nâu, ấn vào bao phấn không tơi thì các bao phấn này dùng để thự phấn nhân tạo sẽ không thành công. Dụng cụ để thụ phấn gồm có: kẹp, cồn, bông.

Các bước thụ phấn hoa:

Bước 1: Chọn hoa mói nở 4 – 6 ngày làm hoa cái.

Bước 2: Loại bỏ túi phấn trong nhị hoa.

Bước 3: Bỏ cánh môi của hoa cái.

Bước 4: Lấy hạt phấn cua hoa mới nở.

Bước 5: Đem hạt phấn thu được rắc vào khoang noãn của hoa cái.

Sau khi thụ tinh 2 – 3 ngày, khoang noãn phình to, các cánh hoa rụng đi. Quả lan bắt đầu hình thành. Nếu thụ phấn thành công sau 4 tháng có thể thu quả để gieo trong ống nghiệm. Do trong một quả số lượng hạt rất nhiều, 1 quả lan có thể mọc ra hàng nghìn, hàng vạn cây. Vì thế trồng lan công nghiệp chủ yếu vẫn dùng phương pháp gieo hạt vô trùng để nhân giống. Hiện nay, tỷ lệ cây giống lan thực sinh chiếm 60 – 70% tổng số giống lan cung cấp cho thị trường.

Các bước gieo hạt trong ống nghiệm thao tác như sau:

1/ Chọn quả lan: nên chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng đều, không bị nứt vỡ, không bị sâu bệnh làm nguyên liệu để gieo hạt.

2/ Dùng cồn 75% rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl₂ 0,1% trong 10 phút. Rửa lại quả bằng nước vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao tách vỏ quả đổ lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trên môi trường đã chuẩn bị sẫn.

Để gieo hạt lan có thể sử dụng các môi trường nền: Knudson, Vacine – Went (VW), Murashige – Skoog (MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu cơ như: dịch nghiền của khoai tây, chuối, cà rốt, nước dừa, pepton…

Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm trên một số giống lan Hồ Điệp nhằm tìm được tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối ưu cho việc nhân giống bằng gieo hạt. Các kết quả thử nghiệm cho thấy: chỉ sau khi thụ phấn > 100 ngày thì hạt lan Hồ Điệp mới đủ độ chín và cho khả năng nảy mầm cao nhất. Đồng thời tất cả các công thức có bổ sung các chất hữu cơ tự nhiên ở dạng riêng rẽ hay tổ hợp đều có thể rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt so với đối chứng từ 5 – 10 ngày. Môi trường bổ sung thêm khoai tây tỏ ra có hiệu quả nhất, chỉ sau 20 ngày tất cả các hạt đã nảy mầm và chất lượng chồi đạt được rất tốt. Trong khi đó trên tất cả nền môi trường có bổ sung cà rốt chỉ có 15 – 60% số hạt nảy mầm và chất lượng mẫu hình thành rất xấu. Như vậy, sử dụng môi trường nền VW có bổ sung: (100ml ND + 10g đường +1g pepton + 30g khoai tây+6,5g agar/l để gieo hạt lan Hồ Điệp là tốt nhất.

3/ Gieo sau 20 ngày hạt nảy mầm, sau 50 – 60 ngày hình thành thể tiền chồi (Protocorm) kích thước 1 – 2mm. Sau đó, chuyển các thể tiền chồi sang môi trường: vw + (100mlND +10g đường + 1g pepton + 6,5g agar + 30g khoai tây 4- 30g cà rốt)/l để hình thành các cây non có 2 – 3 lá sau 60 ngày. Tiếp tục cấy chuyển cây non sang chính môi trường này, khoảng 60 ngày sau sẽ tạo cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn ươm. Vì vậy, thời gian ra cây sau khi gieo là khoảng 6 tháng.

Những nghiên cứu về nhân giống lan Hồ Điệp bằng gieo hạt của nhiều tác giả khác cũng thu được các kết quả tương tự. Ví dụ: khi gieo hạt trên môi trường Hoa Bảo số 1 (N – P – K = 7 – 9 – 16) + Chuối nghiền 50g/l + Pepton 2g/l + đường sacarose 20g/l + agar 8g/l sau 15 ngày có thể quan sát được phôi màu xanh nhạt, sau 50 – 60 ngày hình thành thể tiền chồi kích thước 1,5 – 2mm, sau đó chuyển sang môi trường Hoa Bảo số 1 hoặc môi trường MS + 1mg/l BA, sau 50 – 60 ngày hình thành ra cây non có 2 – 3 lá. sau đó lại cấy chuyển sang môi trường ra rễ của Hoa Bảo số 1, khoảng 60 ngày sau sẽ mọc ra cây 6 – 8cm hoàn chỉnh.

Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào

Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào còn gọi là nhân giống vô tính in vitro. Cách nhân giống này cho phép tạo ra các cây đồng nhất với nhau và đồng nhất với cây mẹ về màu sắc, kiểu dáng hoa cũng như các đặc điểm sinh học khác. Các bộ phận của cây như: đỉnh ngọn, lá, chóp rễ, cành hoa non, nách hoa, đốt của cuống hoa… đều có thể sử dụng làm vật liệu ban đầu cho quá trình nuôi cấy. Nhưng chủ yếu vẫn dùng chồi nách (mắt ngủ) của cành hoa hoặc lá của các cây trong ống nghiệm để nuôi cấy.

Các bước nhân giống vô tính in vi tro bao gồm

a) Nuôi cấy khởi động

Nguyên liệu nuôi cấy là đỉnh ngọn của các cành hoa non hay các đốt mang mắt ngủ của cành hoa đã nở hết hoa. Sau khi khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl₂ 0,1% hai lần (lần 1 xử lý trong 5 phút sau đó bóc bỏ lá bao và xử lý lần 2 trong 1 phút), cắt các đoạn có đốt mang mắt ngủ dài khoảng 1cm, nuôi cấy trên môi trường thích hợp để các mắt ngủ hình thành chồi hay thể tiền chồi (Protocorm).

Các bước tiến hành:

Bước 1 : Chọn cành đã nở hết hoa hoặc chưa nớ hoa Cành đã nở hết hoa

Bước 2: Cắt cành hoa thành đoạn dài 3 – 4cm có đốt mang mắt ngủ.

Bước 3: Rửa sạch mẫu bằng nước, khử trùng kép bằng HgCl₂ 0,1% (lần 1 trong 5 phút, lần 2 trong 1 phút) và tráng lại bằng nước vô trùng 3 – 5 lần.

Bước 4: Cắt bỏ 2 đầu, giữ lại đoạn thân có chứa mắt ngủ dài 2cm

Bước 5: Cấy mẫu vào môi trường dinh dưỡng đã chuẩn bị sẵn

protocorm, chồi tái sinh từ đỉnh ngọn, mắt ngủ của cành hoa

Để thúc đẩy sự hình thành chồi hay tiền chồi từ mẫu cây, thường phải bổ sung vào môi trường nuôi cây hợp chất cytokmin. Tùy vào giống lan Hồ Điệp và loại mẫu cấy mà sử dụng loại và nồng độ cylokinin khác nhau.

Kết quả nghiên cứu chỉ rõ việc bổ sung BA và Kinetin vào môi trường nuôi cấy có khả năng kích thích sự phát sinh hình thái mẫu cấy của cả hai nguồn mẫu đạt 25 – 55% trong khi đó ở môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng (đối chứng) mẫu cấy không phát sinh hình thái. Sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hai hướng: tạo chồi và tạo thể protocorm. Đối với giống lan Hồ Điệp nghiên cứu, mỗi trường thích hợp cho sự phát sinh hình thái của:

. Đốt cành hoa là:

VW+100mlND + 10g đường + 2mgBA + 0,3mgK + 6,5g agar.

.Đỉnh ngọn cành hoa:

VW + 100mlND+ 10g đường + 3mgK + 6,5g agar.

Trên các môi trường này, sự phát sinh thể protocorm cũng như số protocorm/mẫu cấy là cao nhất.

Zhu Gert Fa (Trung Quốc) cũng sử dụng các đốt của cành hoa đã nở hết hoa làm mẫu cấy. Sau khi khử trùng mẫu, cắt các đoạn có đốt dài khoảng 2cm, nuôi cấy trên môi trường MS + 3 – 5 mg BA/l và giữ ở nhiệt độ dưới 28ºC. Tỷ lệ các nẫu hình thành chồi sinh dưỡng đạt 90% trở lên. Sau khi các chồi sinh dưỡng hình thành, loại bỏ phần cành hoa, nuôi cấy trên môi trường tương tự để thu thể tiền chồi; hoặc cắt phần chồi sinh dưỡng rồi nuôi cây trên môi trường Kyoto hoặc MS + KT 10mg/l + NAA 5mg/l + 10% nước dừa (hoặc nước tảo) + đường mía 20g/l để tạo thể tiền chồi.

Ngoài ra, có thể lấy cành hoa lan còn non (sau khi ra 45 ngày), khử trùng, sau đó cắt thành các đoạn 1 – 1,5cm, nuôi cấy trong môi trường VW +1 – 3 mg BA /l + Đường mía 20g/l. Tỷ lệ phân hoá hình thành thể tiền chồi có thể đạt 63 – 77%,

b) Nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh

Bước tiếp theo trong nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô là nhân nhanh các thể tiền chồi và chồi đã được tạo thành ở giai đoạn trên. Hệ số nhân tăng (từ 1,75 – 3,97) tỷ lệ thuận với nồng độ của BA bổ sung vào môi trường ở nồng độ 0 – 1mg/lít, nhưng khi tăng nồng độ đến 2g/lít thì hệ số nhân lại giảm. Khi gia tăng về hệ số nhân thì tỷ lệ mẫu hình thành chồi cũng như chất lượng chồi giảm. Các kết quả nhận được cũng có qui luật tương tự khi thay thế BA bằng Kinetin. Như vậy, khác hẳn với giai đoạn nuôi cấy khởi động, các Cytokinin tổng hợp không có tác động tích cực trong giai đoạn nhân nhanh.

Để tăng hệ số nhân và bảo đảm chất lượng của chồi, nên sử dụng các dịch nghiền của khoai tây, cà rốt thay cho các Cytokinin tổng hợp. Các nghiên cứu của đã chứng minh việc bổ sung các chất hữu cơ tự nhiên có tác dụng tích cực trong việc tăng hệ số nhân đồng thời cho chất lượng chồi tạo ra tối hơn cả. Tất cả các công thức có hổ sung chất hữu cơ tự nhiên ở trạng thái riêng rẽ hay tổ họp đều cho hệ số nhân cao hơn đối chứng. Các công thức bổ sung tổ hợp của cả khoai tây và cà rốt ở lượng 30g/l lít môi trường cho hệ số nhân cao nhất, có thể xem đây là công thức tối ưu cho việc nhân nhanh thể tiền chồi và chồi.

Trong quá trình nhân nhanh, có thể tạo số lượng cực lớn mẫu cấy bằng việc nuôi cấy các lát mỏng (0,3 – 0,5 mm) của thể tiểu chồi hay chồi non trên môi trường… có bổ sung tổ hợp thích hợp của Auxin và Cytokinin.

Kết quả trên làm rõ vai trò hết sức quan trọng của nguồn mẫu sử dụng làm nguyên liệu để cắt lớp mỏng. Khi nuôi cấy lát cắt mỏng của mắt ngủ và đỉnh ngọn cành hoa hoàn toàn không thu được kết quả. Thể protocorm hay chồi vừa mới được hình thành là nguyên liệu cắt lớp mỏng cho hiệu quả tạo protocorm cao nhất Sự hình thành protocorm chồi từ các lát mỏng

Khác với tác loại khác, chồi lan Hồ Điệp ra rễ và hình thành cây hoàn chỉnh ngay trên môi trường nhân nhanh. Vì vậy, trong quá trình nhân nhanh, khi các cây in vitro đạt tiêu chuẩn (5 – 7 cm) chúng sẽ được tách khỏi bình nuôi để đưa ra vườn ươm.

Đối với lan Hồ Điệp qua 2, 3 lần cấy chuyển thường mẫu nuôi cấy có hiện tượng tiết chất đen vào môi trường làm cho sinh trưởng phát triển của mẫu giảm. Có thể sử dụng một số chất chống oxy hoá để ngăn cản hiện tượng trên.

Những số liệu nghiên cứu cho thấy việc bổ sung các chất như vitamin C, axit citric hay pvp đều có tác dụng hạn chế được sự tiết chất đen của mẫu vào môi trường nuôi cấy và làm tăng sinh trưởng của cây so với đối chứng. Trong 3 chất thì PVP là tỏ ra có tác dụng tốt nhất đối với việc ngăn ngừa hiện tượng hoá đen của môi trường nuôi cấy và nồng độ là 1g PVP/1 môi trường là tốt nhất.

Trong nhân giống vô tính in vitro các nói chung và cây Hồ Điệp nói riêng, việc duy trì mẫu cấy trong giai đoạn nhân nhanh quá dài (qua nhiều lần cây chuyến) sẽ dẫn đến việc xuất các biến dị soma ở cây in vitro. Một trong những dạng biến dị soma thường gặp là sự sinh trưởng, phát triển chậm của cây ở cả giai đoạn nuôi cấy in vitro và giai đoạn vườn ươm, vườn sản xuất.

Kết quả nghiên cứu chứng tỏ đối với lan Hồ Điệp sau lần cấy chuyển thứ 5 thì sinh trưởng của cây in vitro đã giảm rất mạnh. Như vậy, khi nhân giống in vitro lan Hồ Điệp chỉ nên duy trì nguồn mẫu trong khoảng 4-5 lần cấy chuyển là lốt nhất và cần có kế hoạch tạo nguồn nguyên liệu mới đảm bảo cho quá trình nhân giống được liên tục. Sơ đồ tổng quát quy trình nhân giống in vitro lan Hồ Điệp

Nhân giống bằng chồi

Nhân giống cây bằng chồi là 1 kiểu của nhân giống tách cây. Trong điều kiện tự nhiên thuận lợi, trên cành hoa chỗ chồi nách (mắt ngủ) có thể mọc ra cây non, cây non này có thể cắt ra và trồng bình thường thành cây trưởng thành.

Để kích thích sự bật chồi của mắt ngủ trên cành hoa có thể sử dụng các chế phẩm kích thích sinh trưởng có chứa hợp chất Cytokinin hay Antiauxin. Ví dụ:

Chế phẩm của trường Đại học Bách khoa Hannover:

Vaselin: 44,0g

Cetyl/cồn stearin: 9,0g

Paraffin: 5,0g

Tyveen 40: 2,0g

Benzyl adenin (BA) 0,3 – 0,5g

Nước: 40,0g

Chế phẩm lanolin của Griesbach có chứa: 50ppm axit tran – cinnamic (tCA) và 5ppm BA