Kỹ thuật nhân giống hoa cúc bằng nuôi cấy mô

Để hoa cắt nói chung và hoa cúc nói riêng trở thành sản phẩm mang giá trị kinh tế cao. Ngoài những ứng dụng thành công trong sinh học nông nghiệp hiện đại như chọn tạo giống mới, cải tiến kỹ thuật và bảo quản hoa tươi, thì một trong những nhân tố góp phần tạo nên thành tựu trên là sử dụng công nghệ nhân giống in vitro để sản xuất cây con. Đây là biện pháp được dùng phổ biến ở các nước trồng cúc, bởi cúc dễ nhân trong ống nghiệm, hệ số nhân cao, trong một thời gian ngắn có thể cung cấp một số lượng lớn cây con đồng đều và sạch bệnh. Từ nguồn vật liệu ban đầu là một mô cấy (chồi đỉnh, chồi nách, lả non, cánh hoa…) có thể tái tạo ra những cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền, nhiều khi chỉ cần sử dụng một cây ưu việt nhất từ hàng vạn cây trong tập đoàn giống để làm nguyên liệu nhân nhanh. Ở Việt Nam những giống cúc cũ kể cả những giống mới được nhập trồng chưa lâu, nhưng cũng đang trong tình trạng thoái hoá, chất lượng giảm do sâu bệnh, do nhân giống vô tính trong một thời gian dài không được định kỳ phục tráng đã làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, nên chưa đáp ứng được nhu cầu thị trường. Hom nữa việc nhân giống cúc hiện nay chủ yếu là bằng phương pháp giâm cành nên hệ số nhân giống thấp, cây không sạch bệnh và còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu, đặc biệt là mùa hè có nhiệt độ và độ ẩm cao gây khó khăn lớn trong việc nhân cúc trên đồng ruộng. Ngoài ra trong quá trình thu thập nguồn gen, những mẫu giống mới với số lượng còn ít, nhưng được đánh giá có chất lượng cao, để sớm đưa ra sản xuất thì việc nghiên cứu nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy in vitro là rất cần thiết.

Giai đoạn 1: (Tạo nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro): Đây là giai đoạn quan trọng thậm chí quyết định sự thành công của toàn bộ quá trinh nhân giống. Đối với cúc, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồi đỉnh, chồi nách hoặc nụ hoa, mô lá non… Để có tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại phân hoá và sinh trưởng tốt thì giống khác nhau sẽ có chất khử trùng với nồng độ và thời gian khác nhau như HgCl2 0,1% với thời gian 1 – 3 phút, H2O2 15 – 20% trong 15 – 20 phút, hoặc Ca(OCl)2 5 – 7% trong 15 – 20 phút…

Giai đoạn 2: (Tái sinh chồi): Sau khi khử trùng, các mẫu cúc được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng (3 – 5 lần), cắt bỏ phần mô bị tổn thương do tiếp xúc với hoá chất khử trùng, sau đó cắt thành đoạn có chiều dài 1 cm (mô thân mang chồi nách), mẩu lá thành từng miếng nhỏ có kích thước (1 x 1 cm) và nụ hoa có đường kính từ 0,2 – 0,3 cm rồi cấy lên môi trường tái sinh chồi. Khoảng sau 3 tuần cho 85% mẫu sống sạch tái sinh chồi trên môi trường cơ bản MS + 0,6 – 0,8% Agar + 3% Sucrose hoặc khoảng 80% mẫu sống từ mô lá, tái sinh trên môi trường MS + 3% sucrose + 0,7 – 0,8% Agar có bổ sung 1 mg BAP + 0,5 mg a – NAA và 75% mẫu sống từ nụ hoa tái sinh trên môi trường MS + 0, 5 mg BAP + 0,1 mg a – NAA. Ở giai đoạn này nhìn chung sự phát triển của các chồi diễn ra chậm, sau 2 – 3 lần cấy chuyển kết hợp với việc cắt bỏ phần mô bị thoái hoá, tốc độ sinh trưởng của các chồi đã tăng lên, tuy nhiên hiệu quả nhân chồi trên môi trường này còn rất thấp.

Giai đoạn 3: (Tạo và nhân nhanh chồi cúc): Đây là giai đoạn quyết định hiệu quả và tốc độ của công nghệ nhân giống, yêu cầu hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời gian và nguyên liệu mà vẫn có số lượng lớn cây con, sử dụng môi trường đơn giản, hoá chất rẻ, dễ kiếm, các chồi tạo ra phải đồng nhất về mặt di truyền, sức sinh trưởng tốt, khi có rễ đem ra trồng phải có tỷ lệ sống cao, cây khoẻ, khả năng biến dị là thấp nhất, cuối cùng phải cho hiệu quả kinh tế cao. Trong giai đoạn này cho thấy với thời gian khoảng 4 tuần, trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg BAP và 15% nước dừa hoặc trên môi trường MS + 1 mg/1 BAP+0,5 mg/1 a – NAA + 15% nước dừa cho hệ số nhân chồi cúc từ 5,0 – 6,1 lần.

Giai đoạn 4: (Tái sinh cây hoàn chỉnh – tạo rễ cho chồi): Sau một thời gian nhân nhanh chồi, giai đoạn tiếp theo của quá trình nuôi cấy này là tạo rễ cho chồi tức là tạo cây hoàn chỉnh, để cây có thể sinh trưởng phát triển tốt và chuyển ra ngoài vườn ươm, thì khi chồi đạt kích thước nhất định (chiều cao 3- 4 cm), thân lá phát triển tốt sẽ chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ, ở giai đoạn này thường phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin (IAA, IBA, α – NAA…）với hàm lượng thay đổi, đây là nhóm hocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ cho chồi in vitro. Tuy nhiên có những giống cúc dễ dàng hình thành rễ ngay trên môi trường MS mà không cần bổ sung thêm chất điều tiết sinh trưởng hay một phụ gia nào khác. Sau khi đã tìm ra hàm lượng α – NAA và nước dừa thích hợp khoảng sau 2 tuần nuôi cấy, trên môi trường MS có bổ sung từ 0,1 – 0, 2 mg/1 α – NAA + 15% nước dừa hoặc sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS + 0,5 mg/1 a – NAA không cần thêm nước dừa, tỷ lệ ra rễ đạt từ 90 – 100%, mỗi chồi cúc có từ 4 – 6 rễ với chiều dài từ 1, 5 – 2, 5 cm.

Giai đoạn 5: (Chuyển cây từ ống nghiệm ra ngoài đất). Là giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh có đủ thân rễ lá từ ống nghiệm ra ngoài đất, là bước cuối cùng có ý nghĩa quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro và cũng là bước quyết định khả năng ứng dụng toàn bộ quá trình vi nhân giống vào trong sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng có nghĩa là từ môi trường sống nhân tạo rất thuận lợi ra môi trường tự nhiên bên ngoài có nhiều yếu tố biến động như thời tiết, đất đai, sâu bệnh… chính do sự thay đổi đột ngột của điều kiện sống, nên đã gây không ít khó khăn trong việc đưa cây in vitro ra ngoài đất.

Bởi vậy để tạo điều kiện thuận lợi cho cây con khoẻ, sinh trưởng phát triển tốt ở ngoài sản xuất, nhất thiết cây in vitro phải được chuyển tiếp qua giai đoạn vườn ươm, ở đây có thể chủ động hạn chế một số tác nhân bất lợi của môi trường bên ngoài, tạo điều kiện cho cây thích nghi dần với điều kiện sản xuất. Để cây đạt tỷ lệ sống cao, cần được chăm sóc và có các giá thể phù họp. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các giá thể đến tỷ lệ sống của các cây con, giá thể cát tỷ lệ sống là 70%, cát + trấu hun là 80%, trong đó giá thể trấu hun tỏ ra có nhiều ưu điếm hơn trong mọi thời vụ ra cây (nhất là trong mùa hè), tỷ lệ sống của cúc cấy mô đạt trên 85%. Sau khoảng 2 – 3 tuần cây phát sinh lá và rễ mới, chuyển cây ra đất trồng. Trong giai đoạn này có thể bổ sung thêm dinh dưỡng khoáng cho cây bằng cách phun dung dịch N:P:K (20:20:20) nồng độ 1 – 2 g// cho cây, sau khi cây cấy mô đã bén rễ trên giá thể.

Nhìn chung thời gian từ khi cấy mô đến khi đưa cây con ra ngoài sản xuất kéo dài khoảng 12 – 14 tuần, giá thành cho một cây con giống từ 500 – 700 đồng. Sơ đồ nhân giống in vitro cây hoa cúc