Vector chuyển gen
Sự chuyển gen Việc nghiên cứu một gen xác định ở sinh vật eucaryote gặp phải nhiều khó khăn, vì gen đó chỉ là trình tự nhỏ nằm lọt trong toàn bộ gen có kích thước lớn. Để thu nhận lượng gen tinh sạch với hàm lượng lớn ...
Sự chuyển gen
Việc nghiên cứu một gen xác định ở sinh vật eucaryote gặp phải nhiều khó khăn, vì gen đó chỉ là trình tự nhỏ nằm lọt trong toàn bộ gen có kích thước lớn. Để thu nhận lượng gen tinh sạch với hàm lượng lớn người ta phải chuyển và tạo dòng gen đó.
Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B (tế bào nhận) chỉ có thể thực hiện bằng cách đính các gen cần chuyển vào một yếu tố trung gian được gọi là đoạn dẫn.
Những đoạn dẫn này có khả năng hướng dẫn, vận chuyển các đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào nhận. Đoạn dẫn này chính là các vector chuyển gen.
Vector
Vector là phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng hoặc dạng vòng, trong đó, người ta sẽ cài một mảnh DNA (gen quí) cần nghiên cứu. Những mảnh DNA đã được cài gọi là đoạn cài (insert) hoặc DNA ngoại lai hoặc DNA lạ.
Các phân tử DNA nhỏ này thường là những thực khuẩn thể hoặc các plasmid mà trong bộ gen của chúng có tín hiệu cần thiết cho chúng tái bản, nhưng chúng lại không biết tái bản (sinh sôi nẩy nở) một mình. Chúng cần đưa vào trong các tế bào chủ (ví dụ như tế bào vi khuẩn chẳng hạn).
Vector phải có một vùng nhận biết đối với một enzyme giới hạn loại II. Vùng này sẽ là vùng cài lắp một DNA (gen cần nghiên cứu) đã được xử lý bởi cùng enzyme giới hạn. Thật vậy, mỗi một RE tạo ra một đầu so le riêng, có khả năng gắn với một đoạn DNA mang đầu so le tương ứng. Hơn nữa, các vùng nhận biết này thường được đặt vào giữa các gen chỉ thị để tiện theo dõi sự biểu hiện hoạt động của gen tái tổ hợp. Thông thường, đó là những gen kháng kháng sinh, hoặc gen mã hóa tổng hợp enzyme có khả năng chuyển hoá cơ chất tạo màu dễ phát hiện trên mặt thạch.
Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn trong tế bào chủ.
Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng DNA tối đa và dễ biến nạp vào tế bào chủ.
Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ.
Đảm bảo sự di truyền bền vững của một DNA tái tổ hợp.
Chúng không có khả năng sống sót ngoài tế bào chủ và không chuyển vào tế bào chủ khác bằng con đường tiếp hợp.
Có trình tự điều hoà tạo điều kiện thuận lợi cho việc phiên mã của gen được đưa vào.
Khả năng biến nạp lớn nghĩa là có khả năng thấm tốt vào tế bào chủ của vector mang gen tái tổ hợp.
Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần tìm.
Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector.
Ngày nay các vector chuyển gen ngày càng hoàn thiện và tiện lợi cho việc sử dụng. Không có vector nào toàn năng cho sự chuyển gen mà cần có sự lựa chọn tùy đối tượng và tùy kích thước đoạn gen cần tạo dòng. Chúng được cấu tạo với nhiều tính chất chuyên biệt để mang được các trình tự nucleotide như mong muốn.
- Một ứng dụng đầu tiên là để tiến hành một quá trình được gọi là sự tách dòng nhằm khuếch đại lượng lớn bản sao DNA xác định.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn DNA chưa biết.
- Đưa gen mà con người cần nghiên cứu vào tế bào chủ.
- Sản xuất protein từ gen được tạo dòng.
- Sản xuất RNA với khối lượng lớn từ DNA tạo dòng.
Mọi thao tác với DNA và việc tạo dựng các phân tử DNA tái tổ hợp được thực hiện trong ống nghiệm. Nhưng việc tạo dòng một gen momg muốn phải được thực hiện trong tế bào sống. Do vậy, việc biến nạp, tiếp nhận và thể hiện gen trong tế bào sống là cực kỳ quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
Tế bào nhận gen tái tổ hợp phải là một cơ thể phù hợp với gen đó và phải có những biện pháp chọn lọc các tế bào chủ đã tiếp nhận gen.
Ngày nay, người ta đã biết có bốn loại vật chủ thu nhận các vector chuyển gen là
- Vật chủ là vi khuẩn E. Coli và các vi khuẩn khác,
- Vật chủ là nấm men và nấm mốc,
- Vật chủ là tế bào thực vật bậc cao,
- Vật chủ là tế bào động vật có vú.
Những ứng dụng DNA tái tổ hợp
Dựa vào nguồn gốc người ta phân ra
- Các vector là những plasmid,
- Các vector là phage,
- Các vector lai nhân tạo như: cosmid, bluescript.
Dựa vào chức năng người ta phân ra
- Vector tách dòng (có kèm theo sự biểu hiện hoặc không biểu hiện của protein),
- Vector biểu hiện (vector tổng hợp).
là plasmid
Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Tùy các kiểu của plasmid mà số bản sao plasmid bởi vi khuẩn sẽ khác nhau. Một số plasmid chỉ có một bản sao duy nhất vì chúng tự tái bản chỉ một lần trong mổi lần phân bào. Một số khác có số bản sao lớn vì chúng tái bản được nhiều lần trong mỗi chu kỳ phân bào. Những plasmid có từ 10 đến 100 bản sao trong tế bào chủ được xem như plasmid có bản sao cao. Plasmid khác có từ 1 đến 4 bản sao trong tế bào chủ, được xếp vào nhóm có bản sao thấp. Trong sinh vật eucaryote, plasmid chỉ có trong tế bào nấm men.
Mỗi plasmid đều có một chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng tự tái bản DNA. Nếu không có vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, DNA không thể tự tái lập trong tế bào chủ. Với tính chất tự tái bản, plasmid là một vector chuyển gen để nhân dòng DNA cần thiết.
Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng.
Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.
Các plasmid thế hệ thứ nhất
Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1 đã góp phần đầu tiên vào lịch sử tạo dòng. Tuy vậy các plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất.
Plasmid thế hệ thứ hai
pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân dòng trong tế bào E.Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar Rodrigues.
Các plasmid thế hệ thứ 2 được cấu tạo phức tạp hơn bắt nguồn từ plasmid nhỏ và được cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí.
Cấu tạo plasmid pBR322
pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen kháng thuốc, một chống chịu được ampicilline (ampR) và một chống chịu được tetracycline (tetR)
Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh.
Ví dụ, gen kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI.
Việc cài DNA lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc. Nếu chỉ còn một gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn cài. Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp.
Một ứng dụng nữa của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
Các plasmid thế hệ ba
Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn.
Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn
- Dãy pUC như: pUC18 , pUC19
- Dãy Gemini: Plasmid pGEM3 , Plasmid pCR 2.1
- Nhóm các plasmid Bluescript
Dãy pUC
pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số đặc trưng sau
- Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để tổng hợp enzyme β-galactosidase.
- Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt hạn chế.
- Ở pUC18 , vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).
- Ở pUC 18 size 12{ {} rSub { size 8{"18"} } } {}, vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III .....EcoRI).
- Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn.
Cấu tạo plasmid pUC
Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi trường có ampicilline
Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn.
Plasmid pGEM3
Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini)
Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như vùng polylineker của pUC19 .
Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA.
Nhóm các plasmid bluescript
Bluescrip là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là nhóm có tiềm năng nhất hiện nay.
Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng 2.961bp, bao gồm:
Cấu tạo pBluescript SK (+/-)
- Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI) mà không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T 3 size 12{ {} rSub { size 8{3} } } {} và T 7 size 12{ {} rSub { size 8{7} } } {} để thu được đoạn cài RNA cùng chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNA- polymerase của phage T 3 size 12{ {} rSub { size 8{3} } } {} nhận biết promoter T 3 size 12{ {} rSub { size 8{3} } } {} hoặc ngược lại.
- Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc phage f1 .Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus helper). Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều.
Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript.
Trong vector bluescript còn có điểm khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid (bluenscript) ở trong E. Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi khuẩn.
Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.
Các vector chuyển gen là phage
Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn. Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là plasmid
- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn,
- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ,
- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.
Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như
- Thao tác ghép DNA lạ phức tạp,
- DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn
Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc thế hệ thứ nhất.
Phage λ (thế hệ đầu)
Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vi khuẩn
- DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính.
- Cũng như tất cả virus, DNA này được bao bọc trong vỏ protein.
Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách
- Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này.
Cấu tạo của phage λ
- Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với DNA của vi khuẩn.
Các biến hình của phage λ (phage thế hệ sau)
Các phage thuộc thế hệ thứ hai rất đa dạng, mỗi một loại thích ứng với một mục đích sử dụng.
Giảm một số vùng hạn chế giống nhau
Phage λ tự nhiên (chưa biến hình) gọi là phage hoang dại có chứa nhiều vùng hạn chế giống nhau như
- 5 vùng EcoRI
- Nhiều vùng Hind III
Không thể cắt vector này bằng EcoRI hoặc HindIII đề cài vào đây một mảnh DNA lạ. Người ta đã biến hình loại phage λ này chỉ còn chứa một vùng nhận biết của EcoRI tạo ra vector cài và hai vùng EcoRI tạo ra vector thay thế.
- λ NM607 là vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb ở vị trí cắt bởi EcoRI
trong gen CI.
- λ charon 16: DNA được cài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ.
- λ EMBL4 là một vector thay thế, đoạn DNA thay thế dài 23kb.
Làm khuyết những phần không cần thiết
Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế. Khả năng của nó sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genon (bộ gen) lớn hơn 105% (51 ÷ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu.
Người ta tìm cách tăng chiều dài của đoạn được cài bằng cách giảm đi nhiều hoặc ít chiều dài những phần không cần thiết của genon của phage λ. Trong số các vector bỏ 1/3 phần trung tâm giữa gen J và N. Trong khi đó giữ lại đầu 5’ (tay trái) vốn mã hoá cho protein đầu, đuôi. Cũng như đầu 3’ (tay phải) vốn mã hoá cho protein thiết yếu cho sự tái bản và chu kỳ tan.
Phage λ biến hình
Phần trung tâm giữa gen J và N không cần thiết cho sự sinh sản của phage có thể được thay bằng DNA lạ. Các đầu mảnh 5’ và 3’ đều là đầu dính.
Cài một mảnh của operon lacZ
Mục đích là chọn ra phage tái tổ hợp mà đem lại khả năng phân biệt bằng mắt các phage λ đã được sát nhập một đoạn cài vào trong bộ gen của chúng.
Cơ chế phản ứng thủy phân X-Gal bởi enzyme β-galactosidase
Bắt đầu từ phage λ người ta đã cấu tạo nên (biến hình) phage gtλ 11 size 12{ {} rSub { size 8{"11"} } } {} đó là một vector biểu hiện. Phage này có cài vào gen lacZ một DNA cần tạo dòng. Các phage gtλ 11 size 12{ {} rSub { size 8{"11"} } } {} tạo ra được các vùng tan trắng nếu chúng đã được cài DNA lạ vào gen lacZ (gen chịu trách nhiệm tổng hợp β-galactosidase).
Các phage gtλ 11 size 12{ {} rSub { size 8{"11"} } } {} tạo ra vùng tan xanh nếu như chúng không tiếp nhận đoạn cài DNA lạ.
Để phát hiện các phage λ tái tổ hợp, người ta cho vào môi trường chứa phage λ tái tổ hợp (môi trường nuôi cấy) một đường X-Gal (5brome-4chloro- indolyl-β-galactopyroside). Giống như đường lactose, nó bị thuỷ phân bởi enzyme β-galactosidase. Người ta có thể dễ dàng phát hiện khi có mặt của enzyme β-galactosidase .
Các vector chuyển gen M13
Đặc tính cấu tạo: Là phage thể sợi, xâm nhiễm đặc trưng E. Coli. DNA của phage mạch đơn, có kích thước 6,4kb, trong đó có khoảng 10 gen.
Ứng dụng: Do ưu điểm của loại vector này là tạo được một lượng lớn phần tử DNA chỉ mang trình tự của một mạch, nên chúng thường được dùng xác định trình tự nucleotide trong phương pháp Sanger.
Các biến hình của phage M13
- Vector M13 mp2 là dạng đơn giản nhất, có một hoặc hai trình tự nhận biết bởi EcoRI nhận đoạn cài có đầu dính được cắt bởi enzyme EcoRI.
- Vector M13 mp7 được tạo thành bằng cách đưa thêm vị trí cắt hạn chế vào gen lacZ của vector M13 mp2. Vector này có 4 điểm nhận biết bởi bốn enzyme cắt hạn chế: EcoRI, BamHI, SalI và PstI.
Các vector chuyển gen khác
Các cosmid
Đặc tính cấu tạo
Các cosmid là những vector lai nhân tạo từ một plasmid với các trình tự cos của phage λ (được sử dụng từ năm 1978). Các trình tự cos này điều khiển sự đóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu của phage. Khi bao gói các vùng cos đều bị cắt, chỉ còn một phần DNA của cosmid được giới hạn bởi các đầu dính với đoạn cài DNA lạ được bao gói. Trong phản ứng bao gói in vitro, các protein cần thiết cho sự tạo thành đầu và đuôi phải được thêm vào để cho các phage có thể tự hợp thành.
Cosmid là những plasmid có các vùng giới hạn mà tại đây, người ta có thể cài lắp DNA lạ và một gen chống chịu ampicilline. Kích thước cosmid ≈ 5kb do đó, nó có thể nhận được đoạn cài 35÷45kb và có thể tới 47kb (như chúng ta đã thấy ở Mục trên, đầu của phage λ có thể bao gói được 52kb).
Vào thời điểm gây nhiễm E. Coli, DNA tái tổ hợp được phóng vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn các đầu dính sẽ bắt cặp tạo ra cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng và tái bản như một plasmid.
Ưu điểm và ứng dụng của cosmid
Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn.
Cấu tạo cosmid
Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát.
Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng chống chịu với môi trường có ampiciline.
Tuy vậy việc ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả.
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeart - Artificial - Chromosomes)
Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra YAC cho phép tạo dòng với những đoạn DNA dài 150÷1.000kb, trung bình là 350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự.
- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST
- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào
- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự như ori ở plasmid
Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn DNA cần tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay mang một mảnh DNA hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori. Việc cài DNA lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt của DNA lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm men.
Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.
Các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú
Cấu tạo: Tương tự như YAC và bao gồm
- Trình tự TEL
- Trình tự CEN
- Trình tự ARS
Nhưng khác với YAC là trình tự TEL và CEN có nguồn gốc từ người. Điều này cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động vật có vú và giữ được ổn định trong tế bào.
Mục đích sử dụng
Chủ yếu sử dụng nghiên cứu cho các tế bào bậc cao mà chúng ta không sử dụng được với tế bào nấm men. Khi đưa NST vào tế bào chủ, nó cũng tồn tại được và nhân lên trong tế bào chủ.
Các vector là virus của eucaryote
Là những vector từ virus và tế bào tiếp nhận vector này là tế bào eucaryote. Nó có cấu tạo giống như phage λ. Tuy nhiên các loại vector này có tính đặc hiệu cao và người ta xây dựng dựa trên những hiểu biết cụ thể.
