24/05/2018, 14:31

Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật

Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các ...

Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật

Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố chủ yếu bao gồm: C, H, O, N, P, S, K, Mg, Ca và Fe. Trong số này có 6 loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật), đó là C, H, O, N, P và S. Các nguyên tố vi lượng thường là Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Br và B. Tỷ lệ các nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau. Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn có lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau (bảng 13.1):

Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yếu trong tế bào một số nhóm vi sinh vật (% trọng lượng khô)

Theo các tài liệu của Tempest (1969), Pirt (1975) và Herbert (1976) thì thành phần trung bình của các nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung là như sau:

Bảng 13.2: Thành phần các nguyên tố cấu tạo nên sinh khối tế bào

*Các tế bào bao gồm 70% trọng lượng là nước và 30% là các nguyên liệu khô khác. Mức trung bình này được tính theo sinh trưởng của vi khuẩn Gr(-) trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ở nuôi cấy theo mẻ.

Vi khuẩn lưu huỳnh (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) và vi khuẩn đại dương (marine bacteria) có lượng chứa các nguyên tố S, Fe, Na, Cl nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Tảo Silic (diatom) có chứa lượng SiO₂ khá cao trong thành tế bào. Thành phần các nguyên tố hoá học còn thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bào sẽ cao hơn so với khi nuôi cấy trên các môi trường nghèo nguồn N.

Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu cơ, chất vô cơ và nước. Chất hữu cơ thường bao gồm protein, carbon hydrat, lipid, acid nucleic, vitamin và các sản phẩm phân giải của chúng cũng như các chất trao đổi chất. Để phân tích các thành phần hữu cơ trong tế bào thường sử dụng hai phương pháp: một là, dùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau đó tiến hành phân tích định tính và định lượng. Hai là, phá thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết cấu đó. Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ. Khi phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt độ 550⁰ C, chất vô cơ thu được dưới dạng các oxit vô cơ được gọi là thành phần tro. Dùng phương pháp phân tích vô cơ có thể định tính hay định lượng từng nguyên tố vô cơ.

Bảng 13.3:Thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn (theo F.C.Neidhardt et al.,1996)

Chú thích:

(1) -Khối lượng khô của tế bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng 2.8 x 10^-13g.

(2) - Giả thiết Peptidoglycan và Glycogen là 2 thành phần chủ yếu.

(3) - Tế bào chứa vài loại phospholipid, do tính đa dạng của thành phần acid béo giữa các chi vi khuẩn khác nhau và do ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi loại phospholipid.

Nước là thành phần không thể thiếu để duy trì hoạt động sống bình thường của tế bào. Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào. Độ chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô chính là lượng nước trong tế bào, thường biểu thị bằng tỷ lệ % tính theo công thức sau đây:

(Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô) / Trọng lượng tươi x 100%.

Đơn vị trọng lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thường được biểu thị bằng đơn vị g/l hay mg/ml. Phương pháp nung khô tế bào ở nhiệt độ 550⁰C thường làm phân giải một số hợp chất của tế bào vì vậy khi tính trọng lượng khô của tế bào nên dùng phương pháp sấy khô ở 105⁰C hay làm khô ở nhiệt độ không cao trong chân không, hoặc làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại...

Các chất dinh dưỡng và chức năng sinh lý

Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài. Căn cứ vào chức năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5 nhóm lớn:

Nguồn carbon (source of carbon)

Là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng CO₂ làm nguồn C duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh năng lượng.

Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn C. Đường nói chung là nguồn C và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật. Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ trong môi trường chứa glucose và galactose thì vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi là nguồn C tốc hiệu) còn galactose được sử dụng sau (gọi là nguồn C trì hiệu). Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu là glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn...), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose.

Năng lực đồng hoá các nguồn C ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới trên 90 loại hợp chất C, nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1C như methanol, methane...

Nguồn C chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO₂, carbonat... (Bảng 13.4)

Bảng 13.4: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng

Nguồn C	Các dạng hợp chất
Đường	glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin...
Acid hữu cơ	acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc thấp, aminoacid...
Rượu	ethanol
Lipid	lipid, phospholipid
Hydrocarbon	khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin
Carbonate	NaHCO₃, CaCO₃, đá phấn
Các nguồn C khác	Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic...

Hình 13.1: Sản lượng sinh trưởng tối ưu khi vi sinh vật dị dưỡng

sử dụng các nguồn C khác nhau

Nguồn carbon thường được sử dụng trong công nghiệp lên men là rỉ đường (molasses). Sự khác nhau giữa rỉ đường mía và rỉ đường củ cải được thấy rõ trong bảng 13.5

Bảng 13.5: Thành phần hóa học của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía

Thành phần	Tỷ lệ	Rỉ đường củ cải	Rỉ đường mía
Đường tổng số	%	48-52	48-56
Chất hữu cơ khá đường	%	2-17	9-12
Protein (N x 6,25)	%	6-10	2-4
K	%	2-7	1,5-5,0
Ca	%	0,1-0,5	0,4-0,8
Mg	%	khoảng 0,09	khoảng 0,06
P	%	0,02-0,07	0,6-2,0
Biotin	mg/kg	0,02-0,15	1,0-3,0
Acid pantoteic	mg/kg	50-110	15-55
Inositol	mg/kg	5000-8000	2500-6000
Tiamin	mg/kg	khoảng 1,3	khoảng 1,8

Tỷ lệ các nguyên tố trong các hợp chất cao phân tử ở vi sinh vật có thể thấy rõ trong bảng sau đây:

Bảng 13.6: Tỷ lệ các nguyên tố trong các cao phân tử ở tế bào vi sinh vật

Thành phần
% trọng lượng khô
Trung bình	Biên độ dao động
Protein	55	15^c-75	53	7	23	16	1	-
RNA^d	21	5^c –30^e	36	4	34	17	-	10
DNA^d	3	1^c –5^f	36	4	34	17	-	10
peptidoglycan	3	0^g –20^h	47	6	40	7	-	-
Phospholipit	9	0ⁱ-15	67	7	19	2	-	5
Lipopolysaccharide	3	0^h-4^j	55	10	30	2	-	3
Lipit trung tính	-	0-45^k	77	12	11	-	-	-
Acid Teichoic	-	0^l-5^d	28	5	52	-	-	15
Glycogen	3	0-50^k	28	6	49	-	-	-
PHB	-	0-80^k	45	7	37	-	-	-
PHA (C8)^m	-	0-60^k	56	9	23	-	-	-
Polyphosphat^d	-	0-20ⁿ	68	-	61	-	-	39
Cyanophycin^o	-	0-10	-	15	25	27	-	-

Theo Herbert (1976). Các thông số được thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau, không điển hình cho một nhóm nào.
Ở E. coli (trong pha sinh trưởng log). Theo Neidhardt et al. (1990).
Các tế bào có nguồn dự trữ C.
Bao gồm các cao phân tử như ARN, ADN, polyphosphate hoặc một số thành phần của thành tế bào.
Tại mức độ có tỷ lệ sinh trưởng cao.
Các tế bào sinh trưởng chậm.
Các loài ký sinh không có thành tế bào.
Vi khuẩn Gram(+).
Các chủng thay thế nguồn phospholipid bằng các chất tương tự chứa P tự do, trong điều kiện hạn chế nguồn P
Vi khuẩn Gram(-)
Các tế bào trong điều kiện hạn chế nguồn N.
Hạn chế nguồn P.
PHA (polyhydroxyaldehyde) chứa 3-hydroxyoctanoic acid.
Một số nấm men và vi khuẩn.
Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)]._n

*PHB= Poly- β- hydroxy butyrate

Nguồn N (source of nitrogen)

Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa N trong tế bào. Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn năng lượng. Trong điều kiện thiếu nguồn C một số vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy có thể sử dụng một số aminoacid làm nguồn năng lượng. Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân huỷ của protein ( peptone, peptide, aminoacid...), muối ammone, nitrate, N phân tử (N₂), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide...(bảng 13.7)

Bảng 13.7: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng

Nguồn N	Các dạng hợp chất
Protein và các sản phẩm phân giải của protein	peptone, peptide, aminoacid... (một số vi sinh vật tiết men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn rồi mới hấp thu được vào tế bào)
Ammone và muối ammone	NH₃, (NH₄)₂SO_4,... (dễ được hấp thu)
Nitrate	KNO₃ (dễ được hấp thu)
N phân tử	N₂ (với vi sinh vật cố định N)
Các nguồn N khác	purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ một số nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

Nguồn N thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men... Vi sinh vật sử dụng chọn lọc đối với nguồn N. Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh terramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh hơn so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, bởi vì nguồn N trong cao ngô là các sản phẩm phân giải dễ hấp thu của protein. Cao ngô được coi là nguồn N tốc hiệu, còn khô dầu được coi là nguồn N trì hiệu. Loại N tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất. Khi sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô và khô dầu theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giữa giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng terramycin.

Năng lực hấp thu muối ammone và nitrate ở vi sinh vật là khá mạnh. Ion NH₄⁺ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn N tốc hiệu. Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành NH₄⁺rồi mới được vi sinh vật sử dụng. Đa số các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte), vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật, thực vật...đều có thể dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn N. Chẳng hạn các vi khuẩn Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa...đều có thể sử dụng nguồn (NH₄)₂SO₄ và NH₄NO₃ làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO₃ làm nguồn N; nấm sợi có thể sử dụng KNO₃làm nguồn N. Lúc dùng các muối như (NH₄)₂SO₄ để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý là sau khi vi sinh vật hấp thu NH₄⁺thì sẽ làm hạ thấp pH của môi trường. Người ta gọi đó là những muối có tính sinh lý acid. Ngược lại khi dùng các muối nitrate (như KNO₃) sau khi vi sinh vật hấp thu NO₃^- thì sẽ làm nâng cao pH của môi trường. Người ta gọi đó là các muối có tính sinh lý kiềm. Để làm cho pH trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ít bị biến động người ta bổ sung thêm các chất có tính đệm (buffer substance).

Nguồn muối vô cơ (source of inorganic salt)

Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu cá đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số loài vi sinh vật (bảng 13.8).

Bảng 13.8: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng

Nguyên tố	Hợp chất sử dụng	Chức năng sinh lý
P	KH₂PO₄, K₂HPO₄	Là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP... Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường.
S	(NH₄)₂SO₄, MgSO₄	Là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện thế oxy hoá khử trong tế bào.
Mg	MgSO₄	Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase của acid isocitric, polymerase của acid nucleic, thành phần của chlorophyll và bacterio-chlorophyll.
Ca	CaCl₂, Ca(NO₃)₂	Tạo tính ổn định của một số cofactor, enzyme duy trì, cần cho sự dựng trạng thái cảm thụ của tế bào.
Na	NaCl	Thành phần của hệ thống chuyển vận của tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, duy trì tính ổn định của một số enzyme.
K	KH₂PO₄, KH₂PO₄	Là cofactor của một số enzyme, duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào, là nhân tố ổn định của ribosome ở một số vi khuẩn ưa mặn.
Fe	FeS0₄	Thành phần của sắc tố vi khuẩn và một số enzyme, là vật chất nguồn năng lượng của một số vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp chlorophyll và độc tố vi khuẩn bạch hầu.

Trong quá trình sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tố vi lượng. Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10^-8-10^-6 mol/ L môi trường nuôi cấy. Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hoá enzyme. (Bảng 13.9)

Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng

Nguyên tố	Tác dụng sinh lý
Zn	Có mặt trong alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase...
Mn	Có mặt trong peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase
Mo	Có mặt trong reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic.
Se	Có mặt trong reductase glycin, reductase formic.
Co	Có mặt trong mutase glutamic.
Cu	Có mặt trong cytochrome oxydase.
W	Có mặt trong dehydrogenase formic.
Br	Có mặt trong urease, cần cho sự sinh trưởng của vi khuẩn hydrogen.

Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng. Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật là không giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối. Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng thuỷ tinh. Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật.

Vì nhiều nguyên tố vi lượng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi sinh vật. Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng.

Nhân tố sinh trưởng

Nhân tố sinh trưởng (growth factor) là những hợp chất hữu cơ mà có những vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng tuy với số lượng rất nhỏ và không tự tổng hợp đủ so với nhu cầu.

Các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và liều lượng của các nhân tố sinh trưởng. Sau đây là một số ví dụ (bảng 13.10).

Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết dối với một số loài vi sinh vật

Chú thích: 1 mg= 10^-6g; 1ng= 10^-9g

Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli) thậm chí có thể sinh trưởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào. Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí thì cần thiamin (B1) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này. Có trường hợp chưa giải thích được bản chất của nhu cầu về nhân tố sinh trưởng ở một số loài vi sinh vật. Thông thường bổ sung vào môi trường các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ…) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng.

Căn cứ vào sự khác nhau về cấu trúc hoá học và chức năng sinh lý của các nhân tố sinh trưởng người ta chia nhân tố sinh trưởng thành các nhóm vitamin, aminoacid, purine và pyrimidine. Vitamin là nhân tố sinh trưởng được tìm thấy bản chất hoá học sớm nhất. Hiện nay người ta đã phát hiện được nhiều loại vitamin có tác dụng là nhân tố sinh trưởng. Một số vi sinh vật có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng nhiều loại khác lại cần được cung cấp vitamin trong môi trường dinh dưỡng thì mới sinh trưởng được. Vitamin chủ yếu là coenzyme hay cofactor của các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất. Một số vi sinh vật không tự tổng hợp được những aminoacid nào đó, cần bổ sung vào môi trường các aminoacid đó hay bổ sung peptide chuỗi ngắn. Chẳng hạn vi khuẩn Leuconostoc mesenteroides cần tới 17 loại aminoacid mới sinh trưởng đươc. Một số vi khuẩn cần cung cấp D-alanin để tổng hợp thành tế bào. Purine và pyrimidine chủ yếu được dùng làm coenzyme hay cofactor của các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp nucleoside, nucleotide và acid nucleic.

Bảng 13.11: Chức năng của một số vitamin thông thường đối với vi sinh vật

Vitamin	Chức năng	Ví dụ về các vi sinh vật cần cung cấp
Biotin (H)	-Carboxyl hóa (cố định CO₂) -Trao đổi chất một carbon	Leuconostoc mesenteroides (B) Saccharomyces cerevisiae (F)Ochromonas malhamensis (A)Acanthammoeba castellanii (P)
Vitamin B₁₂	-Sắp xếp lại phân tử -Nhóm mang methyl trong trao đổi chất một carbon	Lactobacillus spp. (B) Euglena gracilis (A)Tảo silic và nhiều vi tảo khác (A)Acanthammoeba castellanii (P)
Acid folic	-Trao đổi chất một carbon	Enterococcus faecalis (B) Tetrahymena pyriformis (P)
Acid lipoic	-Chuyển nhóm acyl	Lactobacillus casei (B) Tetrahymena spp. (P)
Acid pantotenic	-Tiền thể của CoA (oxy hóa pyruvat, trao đổi axit béo)	Proteus morganii (B) Hanseniaspora spp. (F)Paramecium spp. (P)
Pyridoxin (B6)	-Trao đổi acid amin	Lactobacillus spp. (B) Tetrahymena pyriformis (P)
Niacin	-Tiền thể của NAD, NADP	Brucella abortus (B) Haemophilus influenza (B)Blastocladia pringsheimii (F)Crithidia fasciculata (P)
Riboflavin (B₂)	-Tiền thể của FAD, FMN	Caulobacter vibrioides (B) Dictyostelium spp. (F)Tetrahymena pyriformis (P)Bacillus anthracis (B)
Thiamin (B1)	-Chuyển nhóm aldehyd (khử carboxyl pyruvat, oxy hóa acid α-keto)	Phycomyces blakesleeanus (F) Ochromonas malhamensis (A)Colpidium campylum (P)

Chú thích: B-Vi khuẩn; F-Vi nấm; A-Vi tảo; P-Động vật nguyên sinh

Nước

Nước là thành phần không thể thiếu để vi sinh vật có thể sinh trưởng. Chức năng sinh lý của nước trong tế bào là:

- Hoà tan và chuyển vận các chất, hỗ trợ cho việc hấp thu chất dinh dưỡng, giải phóng các sản phẩm trao đổi chất.

- Tham gia vào hàng loạt các phản ứng hóa học trong tế bào.

- Duy trì cấu hình thiên nhiên ổn định của các đại phân tử như protein, acid nucleic...

- Là thể dẫn nhiệt tốt, hấp thu tốt nhiệt lượng sinh ra trong quá trình trao đổi chất và khuếch tán kịp thời ra bên ngoài để duy trì sự ổn định của nhiệt độ bên trong tế bào.

- Duy trì hình thái bình thường của tế bào.

- Thông qua quá trình thuỷ phân hay khử nước để khống chế kết cấu của tế bào (enzyme, vi ống, tiên mao...) và sự tháo lắp ở virút.

Tính hữu hiệu của nước đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật thường được biểu thị bằng độ hoạt động (hoạt độ) của nước (water activity, a_w). Đó là tỷ lệ giữa áp lực hơi nước của dung dịch trong những điều kiện nhiệt độ và áp lực nhất định với áp lực của hơi nước thuần khiết trong cùng những điều kiện như vậy:

a_w = p_w/ p_w⁰

Ở đây P_w là áp lực hơi nước của dung dịch, còn a_w⁰ là áp lực của hơi nước thuần khiết. P_w⁰ của nước thuần khiết là 1.0. Dung dịch càng chứa nhiều dung chất (chất hoà tan) thì a_w càng nhỏ. Vi sinh vật thường sinh trưởng trong điều kiện có a_w trong khoảng 0,6-0,99. Đối với một số loài vi sinh vật khi a_w quá thấp thì tốc độ sinh trưởng và tổng sinh khối giảm. Các vi sinh vật khác nhau có a_w thích hợp không giống nhau (bảng 13.12)

Bảng 13.12: aw thích hợp nhất cho sinh trưởng ở một số nhóm vi sinh vật

Nhìn chung a_w thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của vi khuẩn cao hơn của nấm men và nấm sợi. Vi sinh vật ưa mặn có a_w thích hợp nhất cho sự sinh trưởng là khá thấp.

Phần nước có thể tham gia vào các quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Phần lớn nước tồn tại trong tế bào vi sinh vật là nước tự do. Phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào được gọi là nước liên kết. Nước liên kết mất đi khả năng hoà tan và lưu động.

Khái niệm về sự sinh trưởng trong điều kiện hạn chế các chất dinh dưỡng

Ở môi trường nuôi cấy lắc trong phòng thí nghiệm, khi tất cả các chất dinh dưỡng được cung cấp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật đã được thiết kế tối ưu thì sự dư thừa xảy ra vào lúc đầu và các tế bào sinh trưởng theo logarit với tốc độ sinh trưởng là lớn nhất. Tuy nhiên, trong mỗi hệ thống môi trường và kỹ thuật nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật không thể tiếp diễn mãi mà không bị giới hạn trong một khoảng thời gian dài. Một tính toán đơn giản để chứng minh nhận định này là: sau 2 ngày sinh trưởng theo logarit, một tế bào vi sinh vật cứ 20 phút lại nhân đôi một lần sẽ tạo ra xấp xỉ 2 x 10⁴³ tế bào. Giả sử khối lượng trung bình của mỗi tế bào là 10^-12 g thì toàn sinh khối tế bào trên sẽ có khối lượng gấp gần 400 lần khối lượng của quả đất. Vì vậy, trong mỗi một thể tích nuôi cấy, sự sinh trưởng luôn luôn sớm bị giới hạn do sự cạn kiệt của một hoặc vài chất dinh dưỡng.

Thuật ngữ “các chất dinh dưỡng hạn chế” được sử dụng với rất nhiều ý nghĩa, và thường vẫn bị nhầm lẫn. Các chất dinh dưỡng hạn chế có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo hai cách riêng biệt: hóa học và và động học. Sự hạn chế hóa học được định nghĩa là khối lượng lớn nhất sinh khối có thể được tạo ra trong điều kiện giới hạn các chất dinh dưỡng. “Nguyên lý Liebig” bắt nguồn từ các nghiên cứu về sự màu mỡ trong nông nghiệp của Justus von Liebig vào năm 1840. Trong nghiên cứu này ông tìm ra rằng hàm lượng của một chất dinh dưỡng nào đó sẽ quyết định đến năng suất mùa màng, miễn là tất cả các chất dinh dưỡng khác đã có mặt một cách dư thừa (phương trình 1). Giới hạn động học xuất hiện khi nồng độ các chất dinh dưỡng là thấp (trong phạm vi từ miligram tới microgram trong mỗi lit), sự hạn chế các chất dinh dưỡng sẽ điều khiển tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ). Điều khiển động học về tốc độ sinh trưởng thường kéo theo các động lực bão hòa và phương trình Monod (phương trình 2) được sử dụng để mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của các chất dinh dưỡng đối với tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (μ).

X = X₀ + ( S₀ - S) x Y_X/S(1)

μ = μ_max x x s / (K_S + S) (2)

Trong đó S₀ là nồng độ ban đầu và s là nồng độ cuối cùng của các chất dinh dưỡng bị hạn chế S; X(X₀) là nồng độ sinh khối (ban đầu); là sản lượng sinh khối thu được đối với chất dinh dưỡng S, μ_max là tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất, và K_S là hằng số ái lực cơ chất Monod.

Điều này thể hiện rõ trong hình 13.2 đối với sự sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy kín. Các tế bào ban đầu sinh trưởng không giới hạn cho đến khi sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng hạn chế bị hết dần, dẫn đến tốc độ sinh trưởng suy giảm dần, sau đó tốc độ sinh trưởng ngừng hẳn. Đó là lúc đạt đến nồng độ cuối cùng của sinh khối. Trong nuôi cấy liên tục, người bổ sung môi trường một cách liên tục và một lượng môi trường dư thừa được loại bỏ. Tốc độ bổ sung thêm vào của các chất dinh dưỡng bị hạn chế sẽ điều khiển đồng thời cả μ và nồng độ sinh khối trong môi trường nuôi cấy (Pirt, 1975; Kovarova và Egli, 1998).

Hình 13.2: Động học của sự giới hạn sinh trưởng của vi sinh v ật trong nuôi cấy đóng do giới hạn nồng độ của chất dinh dưỡng (cơ chất) S. S 0 là nồng độ cơ chất ban đầu, s là nồng độ thực của cơ chất, X là nồng độ sinh khối; X 0 : nồng độ sinh khối ban đầu; Y: sản lượng sinh khối thu được đối với cơ chất S.

Trong thực nghiệm, người ta có thể nuôi cấy các tế bào trong các điều kiện đã được biết rõ, nhờ đó các chất dinh dưỡng hạn chế sẽ được xác định. Đối với việc nuôi cấy các vi sinh vật dị dưỡng để nghiên cứu và tạo ra các sản phẩm sinh khối, môi trường được thiết kế phổ biến với nguồn carbon và năng lượng giới hạn, tất cả các chất dinh dưỡng khác được cung cấp dư thừa. Tuy nhiên, trong quá trình công nghệ sinh học, sự giới hạn bởi các chất dinh dưỡng chứ không phải nguồn carbon giữ chức năng điều khiển các trạng thái sinh lý và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Sự hạn chế các chất dinh dưỡng nào đó thường kích thích hoặc tăng cường sự tạo thành rất nhiều các sản phẩm trao đổi chất và các enzyme của vi sinh vật. Ví dụ, năng suất sẽ được tăng lên trong quá trình lên men tạo chất kháng sinh do sinh trưởng trong môi trường hạn chế photphat, sự sản xuất acid citric trong môi trường có sự hạn chế Fe-, Mn-, hoặc Zn. Còn sự sinh tổng hợp của NAD là được thực hiện trong điều kiện hạn chế Zn-Mn. Việc tích lũy các nguyên liệu dự trữ nội bào PHB hoặc PHA (chất dẻo sinh học-bioplastic) sẽ bị giới hạn bởi nguồn cung cấp hợp chất giàu nitrogen.

Rõ ràng là sự sinh trưởng của vi sinh vật được điều khiển thường xuyên không phải chỉ bởi một chất dinh dưỡng mà bởi sự kết hợp của hai hay nhiều chất dinh dưỡng đồng thời (Kovarova và Egli, 1998).

Thiết kế và phân tích môi trường sinh trưởng tối thiểu

Để sinh trưởng và tổng hợp các nguyên liệu tế bào cho bản thân mình, vi sinh vật phải thu nhận các thành phần cấu trúc (hay các tiền chất của chúng) và năng lượng cần thiết từ môi trường sống. Do đó, để nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm thì các chất dinh dưỡng phải được cung cấp đầy đủ vào môi trường và các chất dinh dưỡng phải ở dạng mà các vi sinh vật này có thể sử dụng được.

Do có sự đa dạng sinh lý của thế giới vi sinh vật mà có vô số các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau đã được đưa ra, với mục đích hoặc là làm giàu một cách chọn lọc hoặc là để nuôi cấy một nhóm ví sinh vật đặc thù nào đó (LaPage và cs, 1970; Balows và cs 1992; Atlas, 1997). Tất cả các môi trường này đều chứa các thành phần với các chức năng dinh dưỡng rõ ràng, đặc biệt là cân nhắc về chức năng cấu trúc hoặc sinh năng lượng. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu về chất dinh dưỡng được tiến hành định tính chứ không phải định lượng và các chất dinh dưỡng khác nhau được thêm vào nhiều hơn hay ít hơn một cách tùy ý. Ngoài ra, rất nhiều các môi trường nuôi cấy có chứa các thành phần không được biết rõ ràng bởi vì sử dụng các nguyên liệu hữu cơ như ngô, khoai tây,…

Trong cùng những điều kiện như: nhiệt độ hoặc pH, tốc độ sinh trưởng riêng lớn nhất của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi sự đa dạng của các chất dinh dưỡng trong môi trường. Điều này được minh họa một cách cụ thể đối với sự sinh trưởng của Salmonella typhimurium (thí nghiệm bởi Schaechter và cs, 1958). Họ đã sử dụng 22 môi trường có thành phần khác nhau và nhận thấy các tốc độ sinh trưởng khác nhau ở các môi trường trong các điều kiện dư thừa các chất dinh dưỡng. Kết quả cho thấy chất lượng các tiền chất đưa vào môi trường khoáng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng một cách rõ ràng nhất.

Thiết kế môi trường và kiểm tra các chất dinh dưỡng giới hạn

Thiết kế môi trường sinh trưởng

Trong thiết kế môi trường sinh trưởng, quyết định đầu tiên được đưa ra là chọn lựa nồng độ cao nhất cho phép tạo ra sinh khối (X_max), và xác định các chất dinh dưỡng giới hạn (theo nguyên lý Liebig). Điển hình, môi trường sinh trưởng cho các vi sinh vật dị dưỡng được thiết kế với nguồn năng lượng - carbon riêng biệt sẽ giới hạn lượng sinh khối được tạo ra, nhưng ngược lại tất cả các chất dinh dưỡng khác (được thêm vào dưới dạng các hợp chất đơn) được cung cấp dư thừa. Dựa vào giá trị X _max, có thể tính toán được nồng độ tối thiểu của các nguyên tố khác nhau cần thiết trong môi trường nuôi cấy. Để đảm bảo sự dư thừa của tất cả chất dinh dưỡng không giới hạn trong môi trường thì nồng độ của chúng được nhân với nhân tố dư (F_E). Bằng cách này, nồng độ của chất dinh dưỡng đòi hỏi trong môi trường tăng trưởng (E_req) gấp x lần theo lý thuyết đối với nguồn carbon.

E_req₌X _max / Y_X/E x F_E (3)

Y_X/E(the individual average elemental growth yield) là sản lượng tăng trưởng trung bình dựa trên từng nguyên tố.

Một ví dụ cho việc thiết kế môi trường khi giới hạn nguồn carbon, cho phép tạo sản lượng sinh khối khô đạt 10g/l sinh (bảng 13.13). Cần chú ý rằng, trong môi trường này các thành phần được lựa chọn sao cho có thể thay đổi nồng độ của mỗi nguyên tố (ví dụ có thể thay thể MgCl₂ và NaHSO₄ bằng MgSO₄). Hơn nữa, môi trường này chỉ có tính chất đệm yếu (weakly buffered), do đó cần thiết phải khống chế pH trong suốt quá trình sinh trưởng.

Cách thức này được sử dụng cho việc thiết kế môi trường nuôi cấy các vi sinh vật hiếu khí với mật độ sinh khối thấp và trung bình. Phức tạp hơn là thiết kế của môi trường cho nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí, trong đó rất nhiều thành phần của môi trường dễ dàng kết tủa tại thế oxy hóa khử cần thiết, hoặc mật độ tế bào cao trong đó có chứa các chất hòa tan hoặc vấn đề độc tính của một số môi trường.

Bảng 13.13: Thiết kế môi trường tối thiểu bị giới hạn bời nguồn C cho phép sản lưởng sinh khối khô đạt 10g/l a,b

Thành phần môi trường	Nguồn	Năng suất sinh trưởng (g sinh khối khô/g nguyên tố)	Các nhân tố dự thừa với nguồn carbon tương ứng	Khối lượng các nguyên tố (g/l)	Khối lượng các thành phần cấu tạo (g/l)
Glucose	C, năng lượng	1	1	10	25.0
NH₄Cl	N	8	3	3.75	14.33
NaH₂PO₄	P	33	5	1.52	5.88
KCl	K	100	5	0.5	0.95
NaH₂SO4	Na	100	5	0.5	1.87
MgCl₂	Mg	200	5	0.25	0.98
CaCl₂	Ca	100	10	1.0	2.77
FeCl₂	Fe	200	10	0.5	1.13
MnCl₂	Mn	10⁴	20	0.02	0.046
ZnCl₂	Zn	10⁴	20	0.02	0.042
CuCl₂	Cu	10⁵	20	0.002	0.0042
CoCl₂	Co	10⁵	20	0.002	0.0044

Dựa vào sản lượng tăng trưởng của các nguyên tố trong sinh khối khô.
Theo Pirt (1975), Egli và Fiechter (1981). Sản lượng tăng trưởng của C và các nguyên tố vết Zn, Cu, Mo, Mn

Nhân tố Y_X/E được phân tích từ sinh khối khô khi nuôi cấy trong điều kiện không giới hạn tăng trưởng của hệ thống đóng. Đối với carbon, oxy, và hydro, Y_X/E không thể được tính toán chính xác trực tiếp từ các thành phần cơ bản của tế bào do những thành phần này không chỉ tạo nên sinh khối, mà còn có các chức năng trao đổi chất khác.Ngoài ra, trong bảng không nói đến một số lượng lớn các chất nhận điện tử cần thiết phải được đảm bảo cho quá trình sinh trưởng.

Tính chất hóa học của các thành phần trong môi trường sinh trưởng phải được tính đến khi chọn F_E. Ví dụ, phần lớn các nguyên tố vi lượng dễ dàng kết tủa trong môi trường sinh trưởng ở pH trung tính hoặc kiềm và do đó giảm bớt khả năng hấp thụ sinh học (khó khăn để xác định). Do đó, chúng được thêm vào nhiều gấp 10 tới 20 lần (Bridson và Brecker, 1970).

Trong công nghệ sinh học, quá trình nuôi cấy theo mẻ (batch) và nuôi cấy theo mẻ có bổ sung (fed-batch) được nghiên cứu từ lâu vì rất có lợi khi thiết kế các môi trường chứa tất cả nguyên tố với lượng chính xác lượng cần thiết, sao cho tất cả các nguyên tố phải được tiêu thụ hết tại cuối kì tăng trưởng. Tuy nhiên, rất khó khăn có thể đạt được điều này do tính đa dạng của các nguyên tố và sự phụ thuộc của chúng vào điều kiện nuôi cấy.Tất nhiên, trong công nghệ sinh học, việc tối ưu hóa môi trường là rất quan trọng để tính toán sự tiêu thụ chất dinh dưỡng và để hạn chế tối đa sự hao phí nguyên liệu, hóa chất.

Bảng 13.14: Các nhân tố tăng trưởng sản lượng của các chất cho và nhận điện tử

Các chất cho điện tử
H₂	Y_{X/H2 =}12g/mol
S₂O₃	Y_{X/S2O3 =}4g/mol
Fe²⁺	Y_{X/Fe2+ =}0.35g/mol
NH₄⁺- NO₃^-	Y_{X/NH4 =}1.3-2.6/mol
NO₂^_ - NO₃	Y_{X/NO2 =}0.9-1.8g/mol
Chất nhận điện tử
O₂	Y_{X/O2 =}10^a-42^bg/mol
NO₃^- - N₂	Y_{X/NO3 =}27g/mol^c
NO₂^- - N₂	Y_{X/NO2 =}17g/mol^c
N₂O^- - N₂	Y_{X/N2O =}9g/mol^c

a. Đối với các cơ chất khử là methane hoặc n-alkanes.

b. Đối với các chất oxy hóa là glucose.

c. Đối với Paracoccus denitrificans với nguồn carbon là glutamate

Bình luận về bài viết này

Chia sẻ tin đăng đến bạn bè

Lưu tin Gửi Messenger

Trịnh Ngọc Trinh

226 chủ đề

43560 bài viết