Sự vận chuyển electron và phosphoryl hóa oxy hóa

Chuỗi vận chuyển electron được nghiên cứu kỹ nhất là chuỗi ở ti thể. Chuỗi bao gồm một dãy các chất mang electron hoạt động phối hợp với nhau để vận chuyển electron từ các chất cho như NADH và FADH₂ tới các chất nhận như O₂ (Hình 13).

Chuỗi vận chuyển electron ti thể. Các chất mang quan trọng hơn được sắp xếp theo thể khử và thứ tự tương đối chính xác. Trong ti thể chúng được tổ chức thành 4 phức hợp liên kết với nhau bởi CoQ và Cytochrome c. Các electron di chuyển từ NADH và succinat xuôi theo gradien thế khử tới oxy. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các electron di chuyển từ các chất mang với thế khử âm hơn tới các chất mang với thế khử dương hơn, cuối cùng kết hợp với O₂ và H⁺ tạo thành nước. Các electron vận chuyển xuôi theo gradien thế năng tương tự như nước chảy xuôi qua một dãy thác ghềnh. Sự khác nhau trong thế khử giữa O₂ và NADH là lớn, khoảng 1,14V giúp cho việc giải phóng một lượng lớn năng lượng. Sự thay đổi thế năng ở một số điểm trong chuỗi đủ lớn để cung cấp năng lượng cho việc tạo thành ATP tương tự như năng lượng từ thác nước chảy xuống các bánh xe dùng để sản xuất điện. Chuỗi vận chuyển electron đã phân tách toàn bộ năng lượng thoát ra thành các bước nhỏ. Một phần năng lượng giải phóng được bảo tồn ở dạng ATP. Việc vận chuyển electron ở những bước này có thể tạo ra các gradien proton và gradien điện tích. Sau đó các gradien này có thể hướng dẫn tổng hợp ATP.

Giả thuyết hóa thẩm thấu áp dụng vào ti thể. Trong sơ đồ các chất mang được tổ chức không đối xứng bên trong màng trong sao cho các proton di chuyển qua màng trong khi các electron được chuyển dọc theo chuỗi. Việc giải phóng proton vào khoang giữa các màng diễn ra khi các electron được chuyển từ các chất mang như FMN và CoQ (vận chuyển cả electron và proton) tới các thành phần như các protein sắt không-hem (các protein FeS) và các Cytochrome a tới O₂. CoQ vận chuyển các electron từ các phức hợp I và II đến phức hợp III. Cytochrome c vận chuyển các electron giữa các phức hợp III và IV. Số lượng proton di chuyển qua màng ở mỗi vị trí đối với một cặp electron được vận chuyển vẫn còn chưa chắc chắn nhưng có lẽ ít nhất 10 proton phải di chuyển ra phía ngoài trong quá trình oxy hóa NADH. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các chất mang trong chuỗi vận chuyển electron nằm bên trong màng trong của ti thể hoặc màng sinh chất ở vi khuẩn. Sở dĩ vậy vì: (1) Các chất này cần ở sát gần nhau để thuận tiện cho việc chuyền các electron cho nhau; (2) Mục đích của chuỗi là bơm H⁺ qua màng để tạo thành gradient H⁺, do đó nếu không có màng cũng sẽ không có gradient. Hệ thống ti thể được sắp xếp thành 4 phức hợp các chất mang, mỗi phức hợp có thể vận chuyển một phần của các electron của con đường tới O₂ (Hình 14). Coenzyme Q và Cytochrome c liên kết các phức hợp với nhau.

Quá trình nhờ đó năng lượng từ sự vận chuyển electron được dùng để tổng hợp ATP được gọi là phosphoryl hoá oxy hoá. Do đó cứ 3 phân tử ATP có thể được tạo thành từ ADP và Pi mỗi khi một cặp electron chuyển từ NADH tới một nguyên tử của O₂. Điều này cũng chi như nói tỉ lệ của phosphorus đối với oxy (P/O) là bằng 3. Vì các electron từ FADH₂ chỉ đi qua hai điểm phosphoryl hoá oxy hoá nên tỉ lệ P/O cực đại đối với FADH₂ là 2. Ở ti thể tỉ lệ P/O thực sự có thể nhỏ hơn 3 và 2.

Mặc dù một số chuỗi hô hấp ở vi khuẩn tương tự như ở ti thể nhưng nói chung chúng rất khác. Chẳng hạn các chất mang electron (ví dụ các Cytochrome) thường không chi nhau và các chuỗi ở vi khuẩn có thể phân nhánh mạnh mẽ. Các electron thường có thể đi vào chuỗi ở một số điểm và rời khỏi chuỗi qua một số oxydase tận cùng. Các chuỗi ở vi khuẩn cũng có thể ngắn hơn và có tỉ lệ P/O thấp hơn các chuỗi ở ti thể. Như vậy, các chuỗi vận chuyển electron ở sinh vật nhân nguyên thuỷ và sinh vật nhân thật khác nhau trong chi tiết về cấu trúc mặc dù chúng đều hoạt động theo các nguyên tắc cơ bản chi nhau.

Những sự khác nhau trong chuỗi vận chuyển electron thể hiện rõ rệt ở E. coli và Paracoccus denitrificans. Hình 15 là sơ đồ đơn giản chuỗi vận chuyển electron ở E. coli. Mặc dù vi khuẩn này vận chuyển các electron từ NADH tới các chất nhận và vận chuyển các proton qua màng sinh chất nhưng chuỗi vận chuyển ở E. coli hoàn toàn khác với ở ti thể. Chẳng hạn, chuỗi ở E. coli phân nhánh và chứa các Cytochrome rất khác nhau. CoQ hoặc ubiquinol cung cấp các electron cho cả hai nhánh nhưng chúng hoạt động dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau. Nhánh Cytochrome d có ái lực rất cao đối với oxy và hoạt động ở nồng độ oxy thấp. Nhánh này hoạt động kém hiệu quả hơn nhánh Cytochrome o vì không chủ động bơm proton. Nhánh Cytochrome o có ái lực cao trung bình đối với oxy,là một bơm proton và hoạt động ở nồng độ oxy cao hơn.

Paracoccus denitrificans là một vi khuẩn đất, gram âm, kị khí không bắt buộc, có thể sinh trưởng dị dưỡng với hàng loạt chất dinh dưỡng hoặc tự dưỡng với H₂ và CO₂ nhờ là chất nhận electron. Chuỗi vận chuyển electron hiếu khí gồm 4 phức hợp chi như ở ti thể (hình 16a). Ngoài các chất cho như NADH, succinat vi khuẩn nói trên còn oxy hoá metanol, metylamin như nguồn carbon duy nhất cho sinh trưởng. Các electron đi vào chuỗi ở vị trí Cytochrome c. Metanol bị oxy hoá thành formaldehit, chất này được chuyển thành CO₂ và đi vào chu trình Calvin. Khi vi khuẩn sinh trưởng kỵ khí với là chất nhận electron chuỗi sẽ được sắp xếp hoàn toàn khác (Hình 16b).

Hệ thống hô hấp hiếu khí ở E. coli. NADH là nguồn electron. Ubiquinone-8 (Q) liên kết NADH-dehydrogenaza với 2 hệ thống oxydaza tận cùng. Nhánh phía trên hoạt động khi vi khuẩn ở pha ổn định và chứa ít oxy. Ít nhất 5 Cytochrome tham gia vào đây là b₅₅₈, b₅₅₉, b₅₆₂, d và o. Nhánh phía dưới hoạt động khi E. coli sinh trưởng nhanh và nồng độ oxy cao. (Theo: Prescott và cs, 2005).

Phức hợp Cytochrome aa3 không hoạt động. Các electron từ Cytochrome c của chuỗi được chuyển tới nitrite -, oxyd nitric - và oxyd nitro reductase. Nitrate reductase nhận electron từ CoQ. Số lượng proton tách khỏi màng sắp xếp theo kiểu này là không lớn nhưng nhờ vậy vi khuẩn có khả năng sinh trưởng kỵ khí.

Các chuỗi vận chuyển electron ở Paracoccus denitrificans. (a) Chuỗi vận chuyển hiếu khí chi với chuỗi vận chuyển electron ở ti thể và sử dụng oxy là chất nhận electron. Metanol và metilamin cũng có thể chuyển electron cho Cytochrome c. (b) Chuỗi vận chuyển kị khí phân nhánh mạnh mẽ được thực hiện bởi cả các protein của màng và các protein chu chất. Nitrate bị khử thành nitơ phân tử nhờ tác dụng phối hợp của 4 reductase khác nhau tiếp nhận các electron từ CoQ và xit.c. Vị trí di chuyển của proton được chỉ rõ nhưng số lượng proton bao gồm thì còn chưa chắc chắn. Ghi chú: FP= flavoprotein; MD = metanol-dehydrogenase; Nar = nitrate reductase; Nir = nitrite reductase; Nor = oxyt nitric reductase; Nos = oxyt nitrơ reductase. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Mặc dù đã được nghiên cứu tích cực trong nhiều năm nhưng chỉ gần đây cơ chế của phosphoryl hoá oxy hoá mới được chấp nhận rộng rãi theo giả thuyết hoá thẩm thấu (chemiosmosis) do nhà sinh hoá người Anh Peter Mitchell đề xuất đầu tiên vào năm 1951. Theo giả thuyết này chuỗi vận chuyển electron được sắp xếp sao cho các proton được đẩy từ chất nền ti thể ra phía ngoài, còn các electron thì được vận chuyển bên trong chuỗi (hình 17). Sự di chuyển của proton có thể xuất phát từ các núm (loop) của chất mang (hình 14) hay từ tác dụng của các bơm proton đặc biệt thu được năng lượng nhờ sự vận chuyển electron. Kết quả là xuất hiện một động lực proton (proton motive force, PMF) bao gồm một gradien proton và một thế hiệu màng do sự phân bố không đều của điện tích. Khi các proton di chuyển trở lại chất nền ti thể nhờ PMF ATP sẽ được tổng hợp ngược chiều với phản ứng thuỷ phân ATP (hình 17).

Hóa thẩm thấu. Sơ đồ giả thuyết hóa thẩm thấu áp dụng cho chức năng của ti thể. Dòng electron từ NADH tới oxy tạo điều kiện cho các proton di chuyển từ chất nền (matrix) ti thể tới khoang giữa các màng. Kết quả là sự xuất hiện của các gradien proton và gradien điện tích. Khi các proton chuyển trở lại chất nền qua phức hợp F₁F₀, F₁ sẽ tổng hợp ATP. Ở vi khuẩn quá trình diễn ra tương tự nhưng các proton di chuyển từ tế bào chất đến chu chất. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Ở vi khuẩn cũng diễn ra quá trình tương tự: dòng electron tạo điều kiện cho các proton di chuyển ra phía ngoài qua màng sinh chất (Hình 15 và 16) sau đó ATP được tổng hợp khi các proton này khuếch tán trở lại tế bào. PMF cũng có thể hướng dẫn vận chuyển các phân tử qua màng cũng như sự quay của tiên mao nghĩa là đóng vai trò trung tâm trong sinh lý học của vi khuẩn (Hình 18). Giả thuyết hoá thẩm thấu được chấp nhận bởi hầu hết các nhà vi sinh vật học. Việc tạo thành gradien proton và gradien điện tích qua màng đã được chứng minh rõ rệt. Tuy nhiên, chứng cớ gradien proton là động lực trực tiếp của phosphoryl hoá oxy hoá vẫn chưa được khẳng định. Ở một số vi khuẩn biển ưa mặn các ion natri có thể được dùng để hướng dẫn tổng hợp ATP.

Vai trò trung tâm của động lực proton (Proton Motive Force. Cần chú ý rằng việc vận chuyển chủ động không phải bao giờ cũng được hướng dẫn bởi PMF. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Màng sinh chất Chất nền Cấu trúc và chức năng của ATP-synthase. (a) Các đặc tính cấu trúc chủ yếu của ATP-synthase. F₁ là cấu trúc hình cầu bao gồm chủ yếu là các dưới-đơn vị luân phiên α và β; 3 vị trí hoạt động nằm trên các dưới-đơn vị β . Dưới đơn vị  kéo dài lên trên qua trung tâm của cấu trúc hình cầu và có thể quay. Phần cuống (các dưới đơn vị  và ε ) nối hình cấu với F₀; F₀ là phức hợp bên trong màng đóng vai trò như 1 kênh proton. F₀ chứa 1 dưới đơn vị a, 2 dưới đơn vị b và 9-12 dưới đơn vị c. Nhánh stato bao gồm dưới đơn vị a, 2 dưới đơn vị b và dưới đơn vị δ ; nhánh stato nằm trong màng và gắn với F 1 . Một vòng các đưới đơn vị c trong F 0 được nối với cuống và có thể tác dụng như 1 roto và chuyển động qua 1 dưới đơn vị của stato. Khi vòng dưới đơn vị c quay nó sẽ làm quay trục (các dưới đơn vị  ε ). (b) Sơ đồ tổng hợp ATP theo cơ chế liên kết thay đổi trong đó thể cầu F1 được nhìn từ phía màng. 3 vị trí hoạt động có thể tồn tại ở 3 hình thể khác nhau: 1 hình thể mở, bất hoạt (O) với ái lực thấp đối với cơ chất và 1 hình thể L bất hoạt có ái lực khá lỏng lẻo đối với cơ chất và 1 hình thể chặt hoạt động (T) có ái lực cao đối với cơ chất. Trong bước đầu tiên ADP và Pi gắn vào vị trí O. Tiếp theo dưới đơn vị  quay 120 o nhờ năng luợng có lẽ từ dòng proton di chuyển qua F 0 . Sự quay này gây ra những thay đổi hình thể trong tất cả 3 dưới đơn vị dẫn đến việc giải phòng ra ATP mới được tạo thành và việc chuyển hóa vị trí L thành 1 hình thể T hoạt động. Cuối cùng ATP được tổng hợp ở vị trí T mới trong khi ADP và Pi lại được liên kết vào vị trí O còn trống và mọi việc lại sẵn sàng cho sự quay tiếp của dưới đơn vị  hướng dẫn nhờ năng luợng. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Dù cơ chế nào là chính xác, việc tổng hợp ATP đều diễn ra trên F₁F₀ ATPase hoặc ATP-synthase (Hình 19). Thành phần F₁ ở ti thể có cấu trúc hình cầu gắn vào bề mặt màng bên trong ti thể bởi một cuống, còn thành phần F₀ được lắp vào màng. F₁F₀ - ATPase ở vi khuẩn lại nằm ở bề mặt bên trong của màng sinh chất. F₀ tham gia vào việc di chuyển của proton qua màng và việc di chuyển này qua một rãnh trong F₀ có thể dùng để hướng dẫn phosphoryl hoá oxy hoá. F₁ là một phức hợp lớn chứa 3 dưới - đơn vị α luân phiên với 3 dưới - đơn vị β. Dưới - đơn vị γ kéo dài từ phức hợp α₃β₃ xuống phía dưới. Dưới - đơn vị này bao gồm một phần của cuống và tương tác với F₀. Dưới - đơn vị δ cũng nằm ở phần cuống. Phần lớn dưới - đơn vị γ gặp ở trung tâm của F₁ được bao quanh bởi các dưới - đơn vị α và β. Dưới - đơn vị  quay nhanh theo hướng trái chiều kim đồng hồ bên trong phức hợp α₃β₃ tựa như trục quay ô tô và gây ra những thay đổi hình thể hướng dẫn tổng hợp ATP ở các vị trí hoạt động trên các dưới - đơn vị β (Hình 19b). Do đó ATP - synthase là một động cơ quay nhỏ nhất hiện biết, nhỏ hơn nhiều so với tiên mạo vi khuẩn.

Ở nồng độ đủ cao nhiều hoá chất kìm hãm tổng hợp ATP trong điều kiện hiếu khí và thậm chí có thể giết chết tế bào. Các chất kìm hãm này, nói chung, có thể được phân thành hai loại. Một số ngăn cản trực tiếp việc vận chuyển electron. Chất kháng sinh pierixidin cạnh tranh với CoQ; chất kháng sinh antimixin A cản trở việc vận chuyển electron giữa các Cytochrome b và c; xianit và azit làm ngừng việc vận chuyển electron giữa Cytochrome a và O₂ do chúng có cấu trúc tương tự với O₂.

Một nhóm chất kìm hãm khác gọi là chất cách li (uncoupler) có tác dụng đình chỉ tổng hợp ATP nhưng không ức chế việc vận chuyển electron. Trên thực tế, các chất cách li cũng có thể nâng cao tốc độ di chuyển của electron. Thông thường, sự vận chuyển electron liên kết chặt chẽ với phosphoryl hoá oxy hoá sao cho tốc độ tổng hợp ATP điều hoà tốc độ vận chuyển electron. Tổng hợp ATP trong phosphoryl hoá oxy hoá diễn ra càng nhanh thì chuỗi vận chuyển electron hoạt động để cung cấp năng lượng cần thiết cũng càng nhanh. Các chất cách li tách riêng phosphoryl hoá oxy hoá khỏi vận chuyển electron. Vì vậy, năng lượng do chuỗi thải ra sẽ ở dạng nhiệt chứ không phải ATP. Nhiều chất cách li như dinitrophenol và valinomixin có thể cho phép các ion H⁺, K⁺ và các ion khác qua màng mà không hoạt hoá F₁F₀-ATPase. Kết quả là các gradien pH và ion bị phá huỷ. Valinomixin cũng có thể liên kết trực tiếp với F₁F₀-ATPase và kìm hãm hoạt tính của enzyme này.

Sản lượng cực đại của ATP ở các sinh vật nhân thật trong quá trình đường phân, chu trình TCA và vận chuyển electron có thể được tính toán dễ dàng. Sự chuyển hoá glucose thành 2 pyruvate trong đường phân cho 2NADH và 2 ATP. Vì 1 NADH ở tế bào chất có thể sản ra cực đại 2-3 ATP trong vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá (tỉ lệ P/O = 2 hoặc 3), tổng sản lượng ATP khi có mặt O₂ của con đường phân là 6-8 phân tử.

Sản lượng ATP từ sự oxy hóa glucose ở tế bào nhân thật. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Con đường đường phân
Phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất (ATP)	2ATP
Phosphoryl hóa oxy hóa với 2NADH	4-6ATP
2Pyruvate thành 2Acetyl-CoA
Phosphoryl hóa oxy hóa với 2NADH	6ATP
Chu trình TCA
Phosphoryl hóa ở mức độ cơ chất (GTP)	2ATP
Phosphoryl hóa oxy hóa với 6NADH	18ATP
Phosphoryl hóa oxy hóa với 2FADH2	4ATP
Tổng sản lượng hiếu khí	36-38ATP
a/ Sản lượng ATP được tính với tỉ lệ P/O được thừa nhận là 3 đối với NADH và 2 đối với FADH2b/ Sản lượng ATP được tính tùy thuộc vào việc các electron của NADH đi vào ti thể như thế nào.

Khi O₂ có mặt và chuỗi vận chuyển electron hoạt động pyruvate sẽ bị oxy hoá tiếp thành Acetyl-CoA tức cơ chất cho chu trình TCA. Phản ứng này sản ra 2NADH vì 2 pyruvate xuất hiện từ một glucose, do đó 6ATP nữa được tạo thành. Việc oxy hoá một phân tử Acetyl-CoA trong chu trình TCA sản ra 1GTP (hoặc ATP), 3NADH và 1FADH₂ nghĩa là nếu 2 phân tử Acetyl - CoA bị oxy hoá trong chu trình trên thì sẽ xuất hiện 2GTP (ATP), 6NADH và 2FADH₂. Theo bảng 9.2 việc oxy hoá NADH và FADH₂ trong chu trình thông qua chuỗi vận chuyển electron sẽ cung cấp tối đa là 38ATP. Tuy nhiên, những tính toán được tóm tắt và trình bày ở bảng 9.2 chỉ là lý thuyết và dựa vào tỉ lệ P/O (số lượng ATP tạo thành khi một nguyên tử oxy bị khử bởi 2 electron trong sự vận chuyển electron) là 3 đối với việc oxy hoá NADH và 2 đối với việc oxy hoá FADH₂. Trên thực tế tỉ lệ P/O có lẽ vào khoảng 2,5 đối với NADH và 1,5 đối với FADH₂. Như vậy tổng sản lượng ATP trong điều kiện hiếu khí có thể xấp xỉ chỉ 30 hơn là 38ATP.

Vì các hệ thống vận chuyển electron ở vi khuẩn thường có tỉ lệ P/O thấp hơn hệ thống ở ti thể nên sản lượng ATP ở vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí có thể ít hơn. Chẳng hạn, E. coli với chuỗi vận chuyển electron ngắn có tỉ lệ P/O khoảng 1,3 khi sử dụng nhánh cytochrome bo ở nồng độ oxy cao và chỉ 0,67 khi sử dụng nhánh Cytochrome bd (Hình 15) ở nồng độ oxy thấp. Trong trường hợp này việc tạo thành ATP thay đổi tuỳ theo điều kiện môi trường. Có lẽ vì thường sống ở những nơi như đường ruột rất giàu chất dinh dưỡng mà E. coli không cần phải tổng hợp ATP thật hiệu quả. Chuỗi vận chuyển electron chỉ hoạt động khi E. coli sống trong môi trường nước ngọt, hiếu khí giữa các vật chủ.

Rõ ràng, hô hấp hiếu khí hiệu quả hơn rất nhiều so với các quá trình kỵ khí không bao gồm sự vận chuyển electron và phosphoryl hoá oxy hoá. Chẳng hạn, dưới điều kiện kỵ khí khi NADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận chuyển electron chỉ 2ATP được tạo thành trong sự phân giải glucose thành pyruvate. Khi chuyển từ điều kiện kỵ khí sang điều kiện hiếu khí nhiều vi sinh vật giảm mạnh mẽ tốc độ phân giải đường và chuyển sang hô hấp hiếu khí. Đây là một hiện tượng điều chỉnh được gọi là hiệu ứng Pasteur. Hiệu ứng này có lợi rõ ràng cho vi sinh vật vì chỉ cần phân giải một lượng đường ít hơn mà vẫn thu được sản lượng ATP như nhau do quá trình hiếu khí đem lại hiệu quả hơn.