Phương pháp giải trình tự của axit nucleic

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học. Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.

Trước hết, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch DNA được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.

Mạch đơn đã đánh dấu phóng xạ có thể xử lí theo 4 nhóm phản ứng

- Nhóm phản ứng thứ nhất xử lí mạch đơn DNA bằng dimethyl sulphat làm đứt mạch tại G.

- Nhóm phản ứng thứ hai xử lí mạch đơn DNA bằng axit (pH=2) gây đứt mạch đơn tại A hoặc G.

- Nhóm phản ứng thứ ba xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin gây đứt mạch đơn tại T và C.

- Nhóm phản ứng thứ 4 xử lí mạch đơn DNA bằng hydrazin với nồng độ muối cao làm đứt mạch đơn tại C.

Kết quả: Các phản ứng tạo thành các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau. Điện di trên gel polyacriamid (Hình 7-5), đọc kết quả điện di bằng máy phóng xạ tự ghi ta thu được trình tự nucleotide của mạch đơn DNA.

Sau khi xử lí bằng phương pháp hóa học và cắt mạch đơn nói trên ta thu được các phân đoạn sauKết quả phản ứng các nhóm

Tổng hợp các kết quả, ta thu được trình tự các nucleotide trên mạch đơn DNA, từ đó ta biết được trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.

Phương pháp này được F. Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977. Nguyên tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme DNA-polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Trong phản ứng sử dụng đoạn DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ) và bổ xung thêm 1% ddATP (hoặc ddCTP, ddGTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Các ddNTP mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp. Mỗi loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA- polymerase, dung dịch đệm và có thêm khoảng 1% một loại ddNTP. Kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide và được nhận biết nhờ phương pháp điện di (Hình dưới). Tổng hợp kêt quả phản ứng ở 4 ống, thu được trình tự các nucleotide của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotide trong gen.

Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động

Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome). Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau. Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacriamid, kết quả sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính.