khả năng chuyển hóa vật chất của vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên

Sự phân giải xenluloza

a.. Xenluloza trong tự nhiên

Xenluloza là thành phần chủ yếu của màng tế bào thực vật. Ở cây bông, xenluloza chiếm tới 90% trọng lượng khô, ở các loại cây gỗ nói chung xenluloza chiếm 40 - 50%. Hàng ngày, hàng giờ, một lượng lớn xenluloza được tích luỹ lại trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống. Một phần không nhỏ do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, phoi bào, mùn cưa v.v.... Nếu không có quá trình phân giải của vi sinh vật thì lượng chất hữu cơ khổng lồ này sẽ tràn ngập trái đất.

Xenluloza có cấu tạo dạng sợi, có cấu trúc phân tử là 1 polimer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccarrit gọi là xenlobioza. Xenlobioza có cấu trúc từ 2 phân tử D - glucoza. Cấu trúc bậc 2 và bậc 3 rất phức tạp thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liên kết hydro. Lực liên kết hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, bởi vậy xenluloza là hợp chất khó phân giải. Dịch tiêu hoá của người và động vật không thể tiêu hoá được chúng. Động vật nhai lại tiêu hoá được xenluloza là nhờ khu hệ vi sinh vật sống trong dạ dày cỏ.

b. Cơ chế của quá trình phân giải xenluloza nhờ vi sinh vật

Xenluloza là một cơ chất không hoà tan, khó phân giải. Bởi vậy vi sinh vật phân huỷ xenluloza phải có một hệ enzym gọi là hệ enzym xenlulaza bao gồm 4 enzym khác nhau. Enzym C₁ có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến dạng xenluloza tự nhiên có cấu hình không gian thành dạng xenluloza vô định hình, enzym này gọi là xenlobiohydrolaza.

Enzym thứ hai là Endoglucanaza có khả năng cắt đứt các liên kết β - 1,4 bên trong phân tử tạo thành những chuỗi dài. Enzym thứ 3 là Exo - gluconaza tiến hành phân giải các chuỗi trên thành disaccarit gọi là xenlobioza. Cả hai loại enzym Endo và Exo - gluconaza được gọi là C_x. Enzym thứ 4 là β - glucosidaza tiến hành thủy phân xenlobioza thành glucoza.

c. Vi sinh vật phân huỷ xeluloza

Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenluloza nhờ có hệ enzym xenluloza ngoại bào. Trong đó vi nấm là nhóm có khả năng phân giải mạnh vì nó tiết ra môi trường một lượng lớn enzym đầy đủ các thành phần. Các nấm mốc có hoạt tính phân giải xenluloza đáng chú ý là Tricoderma. Hầu hết các loài thuộc chi Tricoderma sống hoạt sinh trong đất và đều có khả năng phân huỷ xenluloza. Chúng tiến hành phân huỷ các tàn dư của thực vật để lại trong đất, góp phần chuyển hoá một lượng chất hữu cơ khổng lồ. Tricoderma còn sống trên tre, nứa, gỗ tạo thành lớp mốc màu xanh phá huỷ các vật liệu trên. Trong nhóm vi nấm ngoài Tricoderma còn có nhiều giống khác có khả năng phân giải xenluloza như Aspergillus, Fusarium. Mucor ...

Nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ xenluloza, tuy nhiên cường độ không mạnh bằng vi nấm. Nguyên nhân là do số lượng enzym tiết ra môi trường của vi khuẩn thường nhỏ hơn, thành phần các loại enzym không đầy đủ. Thường ở trong đất có ít loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ 4 loại enzy, trong hệ enzym xenlulaza. Nhóm này tiết ra một loại enzym trong hệ enzym xenlulaza. Nhóm này tiết ra một loại enzym, nhóm khác tiết ra các loại khác, chúng phối hợp với nhau để phân giải cơ chất trong mối quan hệ hỗ sinh.

Nhóm vi khuẩn hiếu khí bao gồm Pseudomonas, Xenllulomonas, Achromobacter.

Nhóm vi khuẩn kị khí bao gồm Clostridium và đặc biệt là nhóm vi khuẩn sống trong dạ cỏ của động vật nhai lại. Chính nhờ nhóm vi khuẩn nàu mà trâu bò có thể sử dụng được xenluloza có trong cỏ, rơm rạ làm thức ăn. Đó là những cầu khuẩn thuộc chi Ruminococcus có khả năng phân huỷ xenluloza thành đường và các axit hữu cơ.

Ngoài vi nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ xenluloza. Người ta thường sử dụng xạ khuẩn đặc biệt là chi Streptomyces trong việc phân huỷ rác thải sinh hoạt. Những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 45 - 500C rất thích hợp với quá trình ủ rác thải.

Sự phân giải tinh bột

a. Tinh bột trong tự nhiên

Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu là của thực vật, bởi vậy nó chiếm một tỉ lệ lớn trong thực vật, đặc biệt là trong những cây có củ. Trong tế bào thực vật, nó tồn tại ở dạng cáchạt tinh bột. Khi thực vật chết đi, tàn dư thực ích luỹ ở trong đất một lượng lớn tinh bột. Nhóm vi sinh vật phân huỷ tinh bột sống đất sẽ tiến hành phân huỷ chất hữu cơ này thành những hợp chất đơn giản, chủ yếu là đường và ãit hữu cơ.

Tinh bột gồm 2 thành phần amilo và amipectin. Amilo là những chuỗi không phân nhánh bao gồm hành trăm đơn vị glucoza liên kết với nhau bằng dãy nối 1,4 glucozit. Amilopectin là các chuỗi phân nhánh; các đơn vị glucoza liên kết với nhau bằng dây nối 1,4 và 1,6 glucozit (liên kết 1.6 glucozit tại những chổ phân nhánh). Amilopectin chính là dạng liên kết của các amilo thường chiếm 10 -30%, amilopectin chiếm 30 - 70%. Đặc biệt có một số dạng tinh bột ở một vài loại cây chỉ chứa một trong hai thành phần amilo hoặc amilope/ctin.

b. Cơ chế của quá trình phân giải tinh bột nhờ vi sinh vật

Vi sinh vật phân giải tinh bột có khả năng tiết ra môi trường hệ enzym amilaza bao gồm 4 enzym:

* α - amilaza có khả năng tác động vào bất kỳ mối liên kết 1,4 glucozit nào trong phân tử tinh bột. Bởi thế α - amilaza còn được gọi là endoamilaza. Dưới tác động của α - amilaza phân tử tinh bột được cắt thành nhiều đoạn ngắn gọi là sự dịch hoá tinh bột. Sản phẩm của sự dịch hoá thường là các đường 3 cacbon gọi là Mantotrioza.

* β - amilaza chỉ có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,4 glucozit ở cuối phân tử tinh bột bởi thế còn gọi là exoamilaza. Sản phẩm của β - amilaza thường là đường disaccarit matoza.

* Amilo 1,6 glucosidaza có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,6 glucosit tại những chỗ phân nhánh của amilopectin.

* Glucoamilaza phân giải tinh bột thành glucoza và các oligosaccarit. Enzym này có khả năng phân cắt cả hai loại liên kết 1,4 và 1,6 glucozit.

Dưới tác động của 4 loại enzym trên, phân tử tinh bột được phân giải thành đường glucoza.

c. Vi sinh vật phân giải tinh bột

Trong đất có nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột. Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra môi trường đầy đủ các loại enzym trong hệ enzym amilaza. Ví dụ như một số vi nấm bao gồm một số loài trong các chi Aspergillus, Fusarius, Rhizopus ... Trong nhóm vi khuẩn có một số loài thuộc chi Bacillus, Cytophaga, Pseudomonas ... Xạ khuẩn cũng có một số chi có khả năng phân huỷ tinh bột.

Đa số các vi sinh vật không có khả năng tiết đầy đủ hệ enzym amilaza phân huỷ tinh bột. Chúng chỉ có thể tiết ra môi trường một hoặc một vài men trong hệ đó. Ví dụ như các loài Aspergillus candidus, A.niger, A.oryzae, Bacillus subtilis, B. mesenterices, Clostridium pasteurianum, C. butiricum ... chỉ có khả năng tiết ra môi trường một loại enzym α - amilaza. Các loài Aspergillus oryzae, Clostridium acetobutilicum ... chỉ tiết ra môi trường β - amiloza. Một số loài khác chỉ có khả năng tiết ra môi trường enzym glucoamilaza. Các nhóm này cộng tác với nhau trong quá trình phân huỷ tinh bột thành đường.

Trong sản xuất người ta thường sử dụng các nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ tinh bột. Ví dụ như các loại nấm mốc thường được dùng ở giai đoạn đầu của quá trình làm rượu, tức là giai đoạn thuỷ phân tinh bột thành đường. Trong chế biến rác thải hữu cơ người ta cũng sử dụng những chủng vi sinh vật có khả năng phân huỷ tinh bột để phân huỷ tinh bột có trong thành phần rác hữu cơ.

Sự phân giải đường đơn

Ở phần trên chúng ta thấy kết quả của quá trình phân giải xenluloza và tinh bột đều tạo thành đường đơn (đường 6 cacbon). Đường đơn tích luỹ lại trong đất sẽ được tiếp tục phân giải các nhóm vi sinh vật phân giải đường. Có hai nhóm vi sinh vật phân giải đường: nhóm háo khí và nhóm lên men.

A. Sự phân giải đường nhờ các quá trình lên men

Sản phẩm của sự phân giải đường nhờ các quá trình lên men là những chất hữu cơ chưa được oxy hoá triệt để. Dựa vào các sản phẩm sinh ra người ta đặt tên cho các quá trình đó:

1. Quá trình lên men etylic

Quá trình lên men etylic còn được gọi là quá trình lên men rượu. Sản phẩm của quá trình là rượu etylic và CO₂. Dưới tác dụng của một hệ thống enzym sinh ra bởi vi sinh vật, glucoza được chuyển hoá theo con đường Embden - Mayerhof để tạo thành pyruvat. Pyruvat dưới tác dụng của men piruvat decacboxylaza và tiamin pirophotphat sẽ khử cacboxyl tạo thành axetaldehyt. Axetaldehyt sẽ bị khử thành rượu etylic. Đó chính là cơ chế của quá trình lên men rượu, quá trình này ngoài tác dụng của hệ thống enzym do vi sinh vật tiết ra còn đòi hỏi sự tham gia của photphat vô cơ.

2C₆H₁₂O₆ + 2H₃PO₄ → 2CO₂ + 2CH₃CH₂OH + 2H₂O

+ fructoza 1,6 diphotphat

Đó là kiểu lên men rượu bình thưuờng. Khi có mặt của NaHCO₃ hay Na₂HPO₄ quá trình lên men sẽ sinh ra một sản phẩm khác là Glyxerin đồng thời hạn chế sự sịn ra rượu etylic.

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng lên men rượu, trong đó mạnh nhất là có ý nghĩa kinh tế nhất là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Người ta thường ứng dụng quá trình lên men rượu để sản xuất rượu, bia nước giải khát lên men. Khi sử dụng nguồn tinh bột để chế tạo rượu thì người ta phải tiến hành 2 bước, bước 1 là quá trình phân huỷ tinh bột thành đường thường dùng các loài nấm mốc phân huỷ tinh bột. Bước 2 mới là quá trình lên men đường thành rượu thường sử dụng nấm men. Để rút ngắn và đơn giản hoá quá trình, một số nhà nghiên cứu đang tiến hành ghép gen phân huỷ tinh bột ở một loài nấm mốc có khả năng phân huỷ tinh bột vào Saccharomyces serevisiae.

Quá trình lên men rượu còn được sử dụng trong công nghiệp làm bánh mỳ, CO₂ sinh ra trong quá trình lên men có tác dụng làm nở bột mỳ. Các nấm men có khả năng lên men rượu còn được dùng trong việc ủ men thức ăn. Thức ăn gia súc được ủ men có hương vị thơm ngon kích thích tiêu hoá của gia súc.

2. Quá trình lên men Lactic

Quá trình phân giải glucoza thành axit lactic được gọi là quá trình lên men lactic. Có 2 loại lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình.

Ở sự lên men lactic đồng hình glucoza bị phân giải theo con đường Embden - Mayerhof tạo thành axit pyruvic, axit pyruvic khử thành axit lactic.

Quá trình lên men lactic đồng hình được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn Lactobacterium và Streptococcus.

Ở sự lên men lactic dị hình glucoza bị phân giải theo con đường pentozophotphat. Sản phẩm của quá trình lên men ngoài axit lactic còn có rượu etylic, axit axetic và glyxerin.

Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi nhiều loại chất sinh trưởng, chúng khó có thể phát triển trên môi trường tổng hợp mà chỉ có thể sống trên môi trường có các chất hữu cơ như nước chiết nấm men, sữa, máu v.v... Chúng thường phân bố trên thực vật hoặc xác thực vật, trong sữa, các sản phẩm của sữa, trong ruột người và động vật.

Quá trình lên men lactic được ứng dụng để chế tạo axit lactic, muối rau quả, chế biến sữa chua v.v... Rau quả được muối, sữa biến thành sữa chua sau quá trình lên men lactic đều có tác dụng tiêu hoá rất tốt. Việc ủ chua thức ăn gia súc cũng dựa trên sự lên men lactic.

Trong quá trình muối dưa, áp suất thẩm thấu do muối tạo ra sẽ làm cho chất dịch bên trong tế bào rau đi ra ngoài. Vi khuẩn lactic có sẵn trong không khí sử dụng dịch tế bào đó để sống, lúc đầu cũng có cả những vi khuẩn hoại sinh khác, sau đó do axit lactic sinh ra làm hạ pH, ức chế các vi khuẩn khác. Đến một pH nhất định vi khuẩn lactic cũng bị ức chế, lúc đó sẽ xuất hiện váng dưa là một loại nấm men chịu pH thấp. Nấm men này phân huỷ axit lactic thành CO₂ và H₂O làm cho dưa giảm độ chua, các loại vi khuẩn hoại sinh do pH lên cao lại phát triển trở lại làm cho dưa bị khú.

Ngoài các quá trình lên men rượu, lên men lactic nói trên, trong thiên nhiên còn có nhiều nhóm vi sinh vật tiến hành phân giải đường nhờ các quá trình lên men khác. Ví dụ như sự lên men propionic, sản phẩm của quá trình là axit propionic, sự lên men focmic, lên men butiric, lên men metan ... sản phẩm của quá trình là axit focmic, rượu butiric, khí mêtan ... các nhóm vi khuẩn trên đều phân bố rộng rãi trong đất và tiến hành phân giải đường đơn thành các sản phẩm khác nhau. Đó là sự phân giải đường nhờ các quá trình lên men.

B. Sự phân giải đường nhờ các quá trình oxy hoá

Ngoài các quá trình lên men, trong thiên nhiên còn có các nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải đường bằng con đường oxy hoá.

Đó là các nhóm vi sinh vật háo khí có khả năng phân huỷ triệt để đường glucoza thành CO₂ và H₂O qua chu trình Crebs (đọc giáo trình sinh hoá học). Sản phẩm của các quá trình háo khí không phải là các chất hữu cơ như ở các quá trình lên men mà là CO₂ và H₂O.

Như vậy nhờ các nhóm vi sinh vật khác nhau mà đường glucoza được sinh ra trong sự phân giải xenluloza và tinh bột lại được phân giải tiếp tục. Các sản phẩm của quá trình phân giải đường do lên men cũng được tiếp tục phân giải. Ví dụ như rượu etylic là sản phẩm của quá trình lên men rượu sẽ được nhóm vi khuẩn axetic chuyển hoá thành axit axetic, đó chính là cơ chế của quá trình sản xuất dấm ăn v.v...

Các hợp chất cacbon hữu cơ trong đất được các nhóm vi sinh vật khác nhau phân huỷ cuối cùng thành CO₂ và H₂O. CO₂ và H₂O lại được nhóm vi khuẩn dinh dưỡng quang năng và thực vật đồng hoá thành chất hữu cơ, khép kín vòng tuần hoàn cacbon, nếu như không có sự hoạt động của các nhóm vi sinh vật trong đất thì vòng tuần hoàn cacbon không thể khép kín, các chất hữu cơ không được phân huỷ và lúc đó tai họa sinh thái sẽ xảy ra dẫn đến sự khủng hoảng sinh cầu, sự sống trên trái đất sẽ không thể tiếp diễn.

3. Sự cố định CO₂

Là quá trình quang hợp của cây xanh và vi sinh vật tự dưỡng quang năng. Quá trình này chuyển hoá CO₂ thành chất hữu cơ - sản phẩm của quá trình quang hợp.

Tóm lại, các nhóm vi sinh vật tham gia trong quá trình chuyển hoá các hợp chất cacbon đã góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất, giữ mối cân bằng vật chất trong thiên nhiên. Từ đó giữ được sự cân bằng sinh thái trong các môi trường tự nhiên. Sự phân bố rộng rãi của các nhóm vi sinh vật chuyển hoá các hợp chất cacbon còn góp phần làm sạch môi trường, khi môi trường bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa cacbon. Người ta sử dụng những nhóm vi sinh vật này trong việc xử lý chất thải có chứa các hợp chất cacbon hữu cơ như xenluloza, tinh bột v.v...

Sự amôn hoá urê

Urê có trong thành phần nước tiểu của người và động vật, chiếm khoảng 2,2% nước tiểu. Urê chứa tới 46,6% nitơ, vì thế nó là một nguồn dinh dưỡng đạm tốt với cây trồng. Tuy nhiên, thực vật không thể đồng hoá trực tiếp Urê mà phải qua quá trình amôn hoá. Quá trình amiin hoá Urê chia ra làm 2 giai đoạn, giai đoạn đầu dưới tác dụng của enzym ureaza tiết ra bởi các vi sinh vật Urê sẽ bị thuỷ phân tạo thành muối cacbonat amoni, giai đoạn 2 cacbonat amoni chuyển hoá thành NH₃, CO₂ và H₂O:

Trong nước tiểu còn có axit uric, tồn tại trong đất một thời gian axit uric sẽ bị phân giải thành urê và axit tactronic. Sau đó urê sẽ tiếp tục bị phân giải thành NH₃.

Nhóm vi sinh vật phân giải Urê và axit uric còn có khả năng amôn hoá cyanamid canxi là một loại phân bón hoá học. Chất này sau khi đi vào đất cũng bị chuyển hoá thành Urê rồi sau đó qua quá trình amôn hoá được chuyển thành NH₃:

Nhiều loài vi khuẩn có khả năng amôn hoá Urê, chúng đều tiết ra enzym ureaza. Trong đó có một số loài có hoạt tính phân giải cao như Planosarcina ureae, Micrococcus ureae, Bacillus amylovorum, Proteus vulgaris ...

Một số loài vi khuẩn có khả năng amôn hoá Urê. Đa số vi sinh vật phân giải Urê thuộc nhóm háo khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, chúng ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm. Bởi vậy khi sử dụng Urê làm phân bón người ta thường kết hợp với bón vôi hoặc tro, đồng thời xới xáo làm thoáng đất.

Sự amôn hoá protein

Khác với lên men, cơ chất của quá trình thối rữa là protein. Protein là một trong những thành phần quan trọng của xác động vật, thực vật và vi sinh vật. Protein thường chứa khoảng 15,0 - 17,6% nitơ (tính theo chất khô). Nếu như tổng lượng cacbon trong cơ thể các sinh vật sống trên mặt đất là vào khoảng 700 tỉ tấn thì tổng lượng nitơ ít ra cũng tới 10 - 25 tỉ tấn. Trong lớp đất sâu 30 cm bao quanh Trái Đất người ta còn thấy thường xuyên có khoảng 3 - 7,5 tỉ tấn nitơ mà phần lớn là tồn tại trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ. Sự phân giải các hợp chất hữu cơ chứa nitơ có ý nghĩa rất lớn đối với nông nghiệp và đối với vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Người ta còn gọi là quá trình phân giải này là quá trình amôn hoá.

Muốn phân giải protein, cũng giống như đối với các hợp chất cao phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzym phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hoá protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polipeptit và các oligopeptit). Các chất này hoặc tiếp xúc được phân huỷ thành axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào, hoặc được xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hoá thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác được tiếp tục phân giải theo những con đường khác nhau để sinh NH₃, CO₂­ và nhiều sản phẩm trung gian khác.

Những vi sinh vật không có khả năng sinh ra các enzym phân giải protein ngoại bào rõ ràng là không có khả năng đồng hoá được các loại protein thiên nhiên. Chúng chỉ có thể sử dụng được các sản phẩm thuỷ phân của protein (polipeptit, oligopeptit, axit amin)

+ Một số axit amin bị deamin hoá bởi VSV nhờ enzym deaminaza, 1 số phản ứng, một trong những sản phẩm cuối cùng là amôn, ví dụ:

Đối với các axit amin có vòng như Triptophan, khi phân giải sẽ tạo thành các hợp chất có mùi thối như Indo vàScaton. Khi phân giải các axit amin chứa S như Metionin, Xistin, vi sinh vật giải phóng ra H₂S, chất này độc đối với cây trồng. Một số hợp chất amin sinh ra trong quá trình amôn hoá có tác dụng độc đối với người và động vật. Ví dụ như histamin, acmatin ... đó chính là nguyên nhân bị nhiễm độc khi ăn thịt cá thiu thối hoặc thịt hộp để quá lâu (ô nhiễm thực phẩm).

Tỷ lệ C : N trong đất rất quan trọng đối với nhóm vi sinh vật phân huỷ protein. Nếu như tỷ lệ này quá cao, trong đất quá ít đạm vi sinh vật sẽ tranh chấp thức ăn đạm đối với cây trồng, chúng phân huỷ được bao nhiêu là hấp thụ hết vào tế bào.

Nếu tỷ lệ C : N quá thấp, đạm dư thừa, quá trình phaâ huỷ sẽ chậm lại, cây trồng không có đạm khoáng mà hấp thụ. Nhiều công trình nghiên cứu đã rút ra tỷ lệ C:N bằng 20 là thích hợp nhất cho quá trình amôn hoá protein, có lợi nhất đối với cây trồng.

Nhiều vi sinh vật có khả năng amôn hoá protein. Trong nhóm vi khuẩn có Bacillus mycoides, Bacillus mesentericus, B. subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium sporogenes ... Xạ khuẩn có Streptomyces rimosus, Stretomyces griseus ... Vi nấm có Aspergillus oryzae, A. flavour, A. niger, Penicilium camemberti v.v....

Ngoài protein và ure, nhiều loài vi sinh vật có khả naăg amôn hoá kitin là một hợp chất cacbon chứa gốc amin. Kitin là thành phần của vỏ nhiều loại côn trùng, giáp xác. Hàng năm kitin được tích luỹ lại trong đất với một lượng không nhỏ. Nhóm vi sinh vật phân huỷ kitin có khả năng tiết enzym kitinaza và kitobiaza phân huỷ phân tử kitin thành các gốc đơn phân tử, sau đó gốc amin được amôn hoá tạo thành NH₃.

Giai đoạn nitrit hoá

Quá trình oxy hoá NH₄⁺ tạo thành NO₂⁺ được tiến hành bởi nhóm vi khuẩn nitrit hoá. Chúng thuộc nhóm vi sinh vật tự dưỡng hoá năng có khả năng oxy hoá NH₄⁺ bằng oxy không khí và tạo ra năng lượng:

NH₄⁺ + 3/2 O₂ → NO₂⁺ + H₂O + 2H + Năng lượng

Năng lượng này dùng để đồng hoá CO₂ → Cacbon hữu cơ

Enzym xúc tác cho quá trình này là các enzym của quá trình hô hấp háo khí. Nhóm vi khuẩn nitrit hoá bao gồm 4 chi khác nhau: Nitrozomonas, Nitrozocystis, Nitrozolobus và Nitrosospira chúng đều thuộc loại tự dưỡng bắt buộc, không có khả năng sống trên môi trường thạch. Bởi vậy phân lập chúng rất khó, phải dùng silicagen thay cho thạch.

Giai đoạn nitrat hóa

Quá trình oxy hoá NO₂^- thành NO₃^- được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn nitrat. Chúng cũng là những vi sinh vật tự dưỡng hoá năng có khả năng oxy hoá NO₂^- tạo thành năng lượng. Năng lượng này được dùng để đồng hoá CO₂ tạo thành đường.

NO₂^- + 1/2 O₂ → NO₃^- + Năng lượng

Nhóm vi khuẩn tiến hành oxy hoá NO₂^- thành NO₃^- bao gồm 3 chi khác nhau; Niitrobacter, Nitrospira và Nitrococcus.

Ngoài nhóm vi khuẩn tự dưỡng hoá năng nói trên, trong đất còn có một số loài vi sinh vật dị dưỡng cũng tiến hành quá trình nitrat hoá. Đó là các loài vi khuẩn và xạ khuẩn thuộc các chi Pseudomonas, Corynebacterium, Streptomyces ...

Quá trình nitrat hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ, nhưng đối với nông nghiệp nó có nhiều điều bất lợi: Dạng đạm nitrat thường dễ bị rửa trôi xuống các tầng sâu, dễ bị đi vào quá trình phản nitrat hoá tạo thành khí nitơ làm cho đất mất đạm. Anion NO₃^- thường kết hợp với ion H⁺ trong đất tạo thành HNO₃ làm cho pH đất giảm xuống rất bất lợi đối với cây trồng. Hơn nữa, lượng NO₃ dư thừa trong đất được cây trồng hấp thu nhiều làm cho hàm lượng nitrat trong sản phẩm lương thực, thực phẩm cao gây độc cho người. Bởi vậy ngày nay người ta thường hạn chế việc bón phân đạm hoá học có gốc nitrat.

Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử

Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ nối với nhau bằng 3 dây nối N  N. Để phá vỡ được 3 dây nối này bằng phương pháp hoá học cần phải tiến hành ở nhiệt độ và áp suất rất cao. Ví dụ như muốn tạo thành xianamit canxi là một loại phân đạm hoá học người ta phải tiến hành phản ứng giữa nitơ phân tử và cacbit canxi ở nhiệt độ 1000 - 1100⁰C.

Nếu muốn liên kết nitơ với hydro để tạo thành amoniac thì phản ứng phải được tiến hành ở nhiệt độ 600⁰C và áp suất 1000at với những chất xúc tác đắt tiền. Trong khi đó nhóm vi khuẩn cố định nitơ có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở các điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất. Vậy cơ chế cố định của nó là như thế nào? Đó là điều các nhà khoa học nghiên cứu trong lĩnh vực này hết sức quan tâm. Từ trước tới nay có rất nhiều giả thiết về cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học.

Đa số nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng: Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá trình khử N₂ thành NH₃ dưới tác dụng của men nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật.

Nitrogenaza đã được chiết xuất ra từ Azotobacter vinelandii - 1loài vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất. Nitrogenaza bao gồm hai thành phần khác nhau, 1 thành phần gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo. Electron của các chất khử sẽ đi vào thành phần thứ 1 của nitrogenza (phần có chứa protein và sắt) sau đó được chuyển sang thành phần thứ 2, qua đó electron được hoạt hoá có thể phản ứng với N₂. N₂ cũng đi qua 2 thành phần của nitrogeneza và được hoạt hoá. Hydro được hoạt hoá nhờ các enzymcủa hệ thống hydrogenaza. Năng lượng dùng trong quá trình này là ATP của tế bào. Cuối cùng NH₃ được hình thành. Có thể tóm tắt trong sơ đồ sau:

Enzym nitrogenaza ngoài tác dụng khử N₂ thành NH₃ còn có khả năng xúc tác cho việc khử một số chất khác. Ví dụ như nó có thể khử axetylen thành etylen. Phản ứng khử axetylen ngày nay được dùng để xác định hoạt tính nitrogenaza.

Azotobater là loại vi khuẩn hiếu khí, song quá trình cố định nitơ lại là một quá trình khử ở điều kiện không có oxy. Hai điều kiện trái ngược nhau được thoả mãn dối với một tế bào là do Azotobacter có nhiều màng lipoporotein. Bên ngoài màng là những men hô hấp hoạt động, sử dụng oxy để hình thành ATP và làm cho oxy không thấm vào phía trong màng, nơi đó có nitrogenaza tiến hành cố định nitơ ở điều kiện kỵ khí.

NH₃ được hình thành đến một mức độ nào đó sẽ kìm hãm sự hoạt động của nitrogenaza, nó chính là yếu tố điều hoà hoạt tính của enzym.

Ở vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu, cơ chế cố định nitơ có phần nào phức tạp hơn vì nó có liên quan đến thực vật. Vai trò của thực vật ở đây chính là sự hình thành Leghemoglobin, chất này đóng vai trò chuỗi chuyển điện tử từ quá trình quang hợp của cây vào nitrogenaza của vi khuẩn. Enzym nitrogenaza của vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với cây đậu cũng có cấu trúc giống như nitrogenaza của vi khuẩn cố định nitơ sống tự do trong đất.

Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có thể biểu diễn bởi sơ đồ sau:

Tuy nhiên gần đây có một số tác giả cho rằng, quá trình cố định nitơ phân tử xảy ra ở tế bào thực vật chứ không xảy ra ở tế bào vi khuẩn. Những tác giả này dựa vào kết quả thí nghiệm dùng nguyên tố phóng xạ N¹⁵ thấy nó xuất hiện chủ yếu ở màng tế bào thực vật trong khi xuất hiện rất ít ở tế bào vi khuẩn.

Vi sinh vật cố định nitơ

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử. Chúng bao gồm 3 nhóm chính: Nhóm vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh, nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do và nhóm vi tảo cố định nitơ. Ở đây chúng ta chỉ nghiên cứu kỹ 2 nhóm đầu.

1. Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh với cây bộ đậu

+ Đặc điểm chung

Vi khuẩn cố dịnh nitơ cộng sinh với cây bộ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Chúng hình thành những nốt sần ở rễ cây, đôi khi ở cả thân cây phần gần với đất và cư trú trong đó. Tại nốt sần, vi khuẩn tiến hành quá trình cố định nitơ, sản phẩm cố định được một phần sử dụng cho vi khuẩn và một phần sử dụng cho cây. Những sản phẩm quang hợp của cây cũng một phần được cung cấp cho vi khuẩn. Chính vì thế mà quan hệ giữa vi khuẩn và cây là quan hệ cộng sinh hai bên cùng có lợi.

Từ năm 1886 Hellrigel và Wilfarth đã phát hiện ra khả năng cố định nitơ của cây đậu Hoà Lan bằng thí nghiệm trồng trên cát cây kiều mạch và cây đậu Hoà Lan. Sau khi kết thúc thí nghiệm người ta tiến hành định lượng đạm tổng số ở 2 chậu cát và nhận thấy: chậu cát trồng cây đậu Hoà Lan có hàm lượng nitơ tăng lên so với ban đầu còn chậu cát trồng kiều mạch thì lượng nitơ giảm đi. Nghiên cứu sâu hơn nữa người ta thấy lượng đạm chỉ tăng lên khi đất trồng cây đậu không khử trùng và nốt sần được hình thành trên rễ cây đậu. Từ đó người ta đã kết luận rằng: cây đậu Hoà Lan khi cộng sinh với một loài vi khuẩn sống trong nốt sần thì sẽ có khả năng cố dịnh nitơ không khí. Đến năm 1888 Beijerinck đã phân lập được vi khuẩn nốt sần, năm 1889 vi khuẩn nốt sần được đặt tên là Rhizobium. Lúc đầu người ta dựa vào cây đậu mà vi khuẩn cộng sinh để đặt tên loài cho chúng. Ví dụ như loài Rhizobium leguminosarum cộng sinh với cây đậu Hoà Lan, loài Rhizobium trifolii cộng sinh với cây cỏ ba lá. Gần đây người ta chia vi khuẩn nốt sần thành hai nhóm, nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm dựa vào thời gian xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy. Nhóm sinh trưởng nhanh khuẩn lạc xuất hiện sau 3 - 5 ngày, có đường kính 2 - 4mm thuộc chi Rhizobium. Nhóm sinh trưởng chậm khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, có đường kính không quá 1mm thuộc chi Bradirhizobium.

Trong quá trình phát triển vi khuẩn nốt sần thường có sự thay đổi hình thái. Lúc còn non, đa số các loài có hình que, có khả năng di động bằng đơn mao, chùm mao hoặc chu mao tuỳ từng loài. Sau đó trở thành dạng giả khuẩn để có hình que phân nhánh, mất khả năng di động. Ở dạng này, vi khuẩn nốt sần có khả năng cố định nitơ. Khi già dạng hình que phân nhánh phân cắt tạo thành dạng hình cầu nhỏ.

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại háo khí, ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm, thích hợp với nhiệt độ 28 - 30⁰C, độ ẩm 60 - 80%. Chúng có khả năng đồng hoá các nguồn cacbon khác nhau như các loại đường đơn, đường kép, axit hữu cơ, glyxerin v.v... Đối với nguồn nitơ, khi cộng sinh với cây đậu, vi khuẩn nốt sần có khả năng sử dụng nitơ không khí. Khi sống tiềm sinh trong đất hoặc được nuôi cấy trên môi trường, chúng mất khả năng cố định nitơ. Lúc đó chúng đồng hoá các nguồn nitơ sẵn có, nhất là các nguồn amôn và nitrat. Chúng có thể đồng hoá tốt các loại axit amin, một số có thể đồng hoá peptôn. Ngoài nguồn dinh dưỡng cacbon và nitơ, vi khuẩn nốt sần còn cần các loại chất khoáng, trong đó quan trọng nhất là photpho. Khi nuôi vi khuẩn nốt sần ở môi trường có sẵn nguồn đạm lâu ngày, chúng sẽ mất khả năng xâm nhiễm và hình thành nốt sần. Đó là điều cần chú ý trong việc giữ giống vi khuẩn nốt sần.

+ Sự hình thành nốt sần và quan hệ cộng sinh của vi khuẩn nốt sần với cây bộ đậu.

Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây đậu tạo thành một thể sinh lý hoàn chỉnh. Chỉ trong quan hệ cộng sinh này, chúng mới có khả năng sử dụng nitơ của không khí. Khi tách ra, cả cây đậu và vi khuẩn đều không thể sử dụng nitơ tự do, không phải tất cả các cây thuộc bộ đậu đều có khả năng cộng sinh với vi khuẩn nốt sần mà chỉ khoảng 9% trong chúng.

Khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu không những phụ thuộc vào vi khuẩn có trong đất mà còn phụ thuộc vào các điều kiện ngoại cảnh khác nhau. Về độ ẩm, đa số cây đậu có thể hình thành nốt sần trong phạm vi độ ẩm từ 40 - 80%, trong đó độ ẩm tối thích là 60 - 70%. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp ngoại lệ, ví dụ như cây điền thanh có thể hình thành nốt sần trong điều kiện đất ngập nước.

Độ thoáng khí của đất cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần. Thường nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần rễ sâu rất ít nốt sần. Nguyên nhân là do tính háo khí của vi khuẩn nốt sần, thiếu Oxy sẽ làm giảm cường độ trao đổi năng lượng và khả năng xâm nhập vào rễ cây. Đối với cây, thiếu Oxy cũng làm giảm sự hình thành sắc tố Leghemoglobin. Những nốt sần hữu hiệu có màu hồng chính là màu của sắc tố này.

Nhiệt độ thích hợp nhất với hoạt động của vi khuẩn nốt sần là 24⁰C, dưới 10⁰C nốt sần vẫn có thể hình thành nhưng hiệu quả cố định nitơ giảm. Ở nhiệt độ 36⁰C cây đậu phát triển tốt nhưng cường độ cố định nitơ lại kém.

pH môi trường cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần. Có loại chỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4 có loại có khả năng hình thành nốt sần ở pH rộng hơn từ 4,6 đến 7,5.

Tính đặc hiệu là một đặc điểm quan trọng trong quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây đậu. Một loài vi khuẩn nốt sần chỉ có khả năng cộng sinh với một hoặc vài loài đậu. Cũng có một số loài vi khuẩn có khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu không đặc hiệu với nó nhưng số lượng nốt sần ít và khả năng cố định nitơ kém. Tuy nhiên đặc tính này giúp cho vi khuẩn nốt sần có thể tồn tại ở những nơi không có cây đậu đặc hiệu đối với nó. Tính đặc hiệu giữa vi khuẩn và cây đậu được quyết định bởi hệ gen của chúng. Bởi vậy người ta có thể cải biến tính đặc hiệu bằng các tác nhân đột biến hoặc có thể dùng kỹ nghệ di truyền để cải biến hệ gen quy định đặc hiệu cộng sinh.

Quá trình hình thành nốt sần được bắt đầu từ sự xâm nhập của vi khuẩn vào rễ cây. Vi khuẩn thường xâm nhập vào rễ cây qua các lông hút hoặc vết thương ở vỏ rễ. Cây đậu thường tiết ra những chất kích thích sinh trưởng của vi khuẩn nốt sần tương ứng, đó là các hợp chất gluxit, các axit amin v.v... Muốn xâm nhiễm tốt, mật độ của vi khuẩn trong vùng rễ phải đạt tới 10⁴ tế bào trong 1 gram đất. Nếu xử lý với hạt đậu thì mỗi hạt đậu loại nhỏ cần 500 - 1000 tế bào vi khuẩn, hạt đậu loại to cần khoảng 70.000 tế bào.

Khi mật độ vi khuẩn phát triển tới một mức độ nhất định nó sẽ kích thích cây đậu tiết ra enzym poligalactorunaza có tác dụng phân giải thành lông hút để vi khuẩn qua đó xâm nhập vào. Đường vi khuẩn xâm nhập được tạo thành do tốc độ phát triển của vi khuẩn (sinh trưởng đến đâu, xâm nhập đến đấy) hình thành một "dây xâm nhập" được bao quanh bởi một lớp nhày do các chất của vi khuẩn tiết ra trong quá trình phát triển. Ở giai đoạn này phản ứng của cây đối với vi khuẩn tương tư như đối với vật ký sinh, bởi vậy tốc độ tiến sâu vào nhu mô của dây xâm nhập rất chậm do phản ứng của cây - chỉ khoảng 5 - 8 μm/h. Không phải tất cả các dây xâm nhập đều tiến tới nhu mô rễ mà chỉ một số trong chúng. Chính vì thế để hình thành nốt sần cần mật độ vi khuẩn lớn.

Khi tới lớp nhu mô, vi khuẩn kích thích tế bào nhu mô phát triển thành vùng mô phân sinh. Từ vùng mô phân sinh tế bào phân chia rất mạnh và hình thành 3 loại tế bào chuyên hoá: Vỏ nốt sần là lớp tế bào nằm dưới lớp vỏ rễ bao bọc quanh nốt sần; Mô chứa vi khuẩn gồm những tế bào bị nhiễm vi khuẩn nằm xen kẽ với các tế bào không nhiễm vi khuẩn. Những tế bào chứa vi khuẩn có kích thước lớn hơn tế bào không chứa vi khuẩn tới 8 lần, có những mô chứa vi khuẩn toàn bộ các tế bào đều bị nhiễm vi khuẩn. Loại tế bào chuyên hoá thứ 3 là các mạch dẫn từ hệ rễ vào nốt sần. Đây chính là con đường dẫn truyền các sản phẩm của quá trình cố định nitơ cho cây và các sản phẩm quang hợp của cây cho nốt sần.

Tại các tế bào chứa vi khuẩn, vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào tế bào chất tại đấy chúng phân cắt rất nhanh. Từ dạng hình que sẽ chuyển sang dạng hình que phân nhánh gọi là dạng giả khuẩn thể. Chính ở dạng giả khuẩn thể nàym vi khuẩn bắt đầu tiến hành quá trình cố định nitơ. Thời kỳ cây ra hoa là thời kỳ nốt sần hình thành nhiều nhất và có hiệu quả cố định nitơ mạnh nhất. Hiệu quả cố định nitơ thường thể hiện ở những nốt sần có kích thước lớn và có màu hồng của Leghemoglobin. Ở những cây đậu có đời sống ngắn từ 1 năm trở xuống, đến giai đoạn cuối cùng của thời kỳ phát triển, màu hồng của sắc tố Leghemoglobin chuyển thành màu lục. Lúc đó kết thúc quá trình cố định nitơ, dạng giả khuẩn thể phân cắt thành những tế bào hình cầu. Khi cây đậu chết, vi khuẩn nốt sần sống tiềm sinh trong đất chờ đến vụ đậu năm sau. Tuy nhiên, có một vài cây họ đậu như cây điền thanh hạt tròn không thấy xuất hiện dạng giả khuẩn.

Ở những cây đậu 1 năm và những cây đậu lâu năm (thân gỗ) cũng có sự khác nhau về tính chất nốt sần. Ở caâ lạc, cây đậu tương, nốt sần hữu hiệu (có khả năng cố định nitơ) thường có màu hồng, kích thước lớn, thường nằm trên rễ chính trong khi nốt sần vô hiệu có màu lục, kích thước nhỏ, thường nằm trên rễ phụ. Tuy nhiên ở một số cây đậu lâu năm lại không theo quy luật đó. Ví dụ như cây keo tai tượng dùng để trồng rừng, nốt sần hữu hiệu có cả ở rễ phụ và không có màu hồng.

- Ứng dụng của vi khuẩn nốt sần

T