Công nghệ DNA tái tổ hợp và sự tách dòng

Khái niệm

DNA

DNA là chữ viết tắt của axit 2’-deoxyribonucleic, được nhà sinh học người Thụy Điển Miescher tìm ra vào năm 1869 trong nhân tế bào bạch cầu (tế bào mủ). Đầu tiên ông gọi nó là nuclein có nghĩa là hạch nhân. Sau đó, ông đã phát hiện ra nó có bản chất axit và gọi nó là axit nucleic. Sau hơn 80 năm cùng với sự tranh cãi của nhiều nhà khoa học, đến năm 1952, người ta mới công nhận DNA là vật chất di truyền.

DNA gồm 3 thành phần chính: bazơ nitơ dạng purine và pyrimidine (A,T,C,G), đường pentose (đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4). Ba thành phần này có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạo thành một nucleotide

Cấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra. Đó là chuỗi xoắn kép cong nhẹ nhàng, có cấu trúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song,đối xứng và bổ sung cho nhau theo một qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp với G nhờ các liên kết hydro. Cấu trúc xoắn kép của Watson- Crick là chiếc chìa khóa để mở ra những kỹ thuật của sự sống.

DNA tái tổ hợp

Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các bazơ nitơ, nhiều nhà nghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.

Vào những năm 70, bằng những phương pháp khác nhau, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên.

Năm 1972, nhóm nghiên cứu của trường đại học Stranford (Paul-Berg) đã đưa ra phương pháp đuôi để nối các phân tử DNA khác nhau. Để tạo đầu dính, người ta sử dụng enzyme terminal transferase. Dưới tác dụng của enzyme này, người ta đã tạo được những đuôi poly nucleotide khoảng 50 đến 100 gốc adenine (polyA) ở đầu OH (3’) của mạch đơn DNA SV 40 (Simian virus 40) và đuôi polyT ở DNA plasmid đã được mở bởi enzyme. Sau khi trộn lẫn hai loại DNA này, các đuôi bổ sung adinine và thymine bắt cặp lại với nhau và với sự có mặt của enzyme ligase, hai DNA này được nối lại và tạo ra plasmid tái tổ hợp vòng. Vì sự an toàn cho cộng đồng nên sản phẩm tái tổ hợp này không được biến nạp trong tế bào chủ. Tuy chưa hoàn tất, nhưng thực nghiệm của Berg đã cho ta hai vấn đề mấu chốt về DNA tái tổ hợp. Ông cho rằng, có thể dùng enzyme để cắt DNA một cách định trước và các đoạn DNA ở các loài khác nhau có thể nối lại với nhau.

Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ. Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã lao vào các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được những kết quả có ứng dụng trong thực tiễn.

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA do Rerg, Chang, Boyer và Cohen đề ra đã giúp các nhà sinh học có thể làm thay đổi tính di truyền của cơ thể sống theo chiều hướng định trước và vượt qua được hàng rào ngăn cản loài. Mỗi tổ hợp DNA mới đều tạo nên những đặc điểm sinh học mới kể cả về mặt di truyền lẫn sinh hóa.

Vậy người ta gọi DNA tái tổ hợp là một DNA lai, tìm được invitro (trong ống nghiệm) bằng cách tổ hợp 2 DNA thuộc 2 loài khác nhau.

Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA tái tổ hợp (Hình dưới).

Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai. Nó chính là một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào DNA của plasmid hay DNA của virus.

Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp

Mục đích tạo DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ...

Những yêu cầu của DNA tái tổ hợp

- DNA tái tổ hợp phải đạt được những yêu cầu cần thiết của một vector chuyển gen.

- DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ.

- DNA tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn. Và dễ quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp.

Chọn nguyên liệu

DNA được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid và DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, được tách và làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid, DNA virus.

DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách và làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.

Các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme ristriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkanline phosphotase, ...

Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE kiểu II

RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg +2 size 12{ {} rSup { size 8{+2} } } {} và không cần năng lượng ATP.

- Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA.

Công đoạn nối với sự có mặt của DNA ligase

Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase.

DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau (Hình 6-2). Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau.

Nối đầu bằng

Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.

Nối đầu lệch

Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những bazơ bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các bazơ nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA ligase. Phản ứng nối được thực hiện theo sơ đồ được biểu diễn trên Hình dưới.

DNA và các phản ứng nối

Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch

Chọn và xử lí DNA plasmid

Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau.

Chọn và xử lí đoạn cài

DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau.

Tạo plasmid tái tổ hợp

Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp. Phản ứng nối xảy ra theo sơ đồ được biểu diễn trên Hình dưới.

Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker)

Chọn và xử lí vector plasmid:(tương tự như trên)

Chọn và xử lí đoạn cài

Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết bởi một enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là G/AATTC.

cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được nhận biết bởi enzyme EcoRI.

Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để tạo phân tử lai.

Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch

Phương pháp dùng đầu lệch

Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp

Tạo vector tái tổ hợp

Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành (Hình dưới).

Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT)

Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA.

Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước sau

Bước 1

Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI (G/GATCC).

Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính.

Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch nhau.

Bước 2

Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ.

Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở.

Bước 3

Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC---) sẽ bắt cặp với nhau.

Bước 4

Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung. Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI.

Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.

Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase

Tách lập các DNA lạ cần tạo dòng

Chọn và cắt DNA lạ của tế bào cho bằng một enzyme cắt hạn chế (RE). Phân lập đoạn DNA (gen quí) phù hợp với vector và mục đích cần tạo dòng.

Trong trường hợp đặc biệt, để tạo dòng một gen chưa biết, người nghiên cứu có thể tổng hợp hóa học đoạn DNA cần tạo dòng khi dự đoán cấu trúc protein do gen chỉ huy tổng hợp hoặc tổng hợp cDNA từ mRNA.

Tạo đầu dính khi cần thiết.

Chọn và xử lí vector

Chọn vector cần phải chú ý những yêu cầu sau: độ lớn của gen lạ (đoạn cài), loại tế bào chủ tiếp nhận vector và phương pháp ứng dụng.

Xử lí vector: cắt vector bằng enzyme cắt hạn chế cùng loại với enzyme đã cắt DNA nói trên (để tạo những vết cắt giống nhau, thuận tiện cho việc nối ghép sau này). Khử nhóm phosphat bằng enzyme alkanline phosphotase để tránh hai đầu vector đóng kín trở lại.

Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)

Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.

Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.

Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp hoặc tải nạp

Công đoạn này nhằm mục đích sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao. Việc chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn tức là làm cho vi khuẩn trở thành khả biến, nghĩa là có khả năng thấm vector tái tổ hợp. Sự thấm này có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc được cảm ứng. Tuy nhiên, nó sẽ phụ thuộc vào loại plasmid sử dụng làm vector và phụ thuộc vào sự định vị của vùng cài lắp chứa bên trong vector mà người nghiên cứu sẽ chọn phương pháp biến nạp hoặc tải nạp.

Biến nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception), không cần sự tiếp xúc giữa hai tế bào hoặc nhân tố trung gian là phage hoặc virus. Biến nạp được thực hiện với vector chuyển gen là plasmid. Có nhiều phương pháp biến nạp như hóa biến nạp, điện biến nạp, biến nạp tế bào trần, phương pháp bắn gen và phương pháp vi tiêm.

Tải nạp là hiện tượng chuyển vật chất di truyền trực tiếp từ tế bào thể cho D (Doner) sang tế bào thể nhận R (Reception) qua nhân tố trung gian là virus. Tải nạp được thực hiện với vector chuyển gen có nguồn gốc là virus như phage, cosmid, ...

Phát hiện dòng cần tìm

Công việc tiếp theo là kiểm tra sự hiện diện của gen mong muốn. Việc chọn lựa những chủng như ý muốn là không đơn giản, vì cách tiến hành thí nghiệm trong một hỗn hợp không đồng nhất nên các dòng vi khuẩn có thể mọc lên theo ba khả năng

- Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid tái tổ hợp,

- Tế bào nhận plasmid nhưng không có gen lạ,

- Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp.

Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà người ta có các phương pháp khác nhau để xác định dòng cần tìm. Nếu mục đích là nghiên cứu đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng đầu dò. Nếu đoạn DNA đã biết (cDNA), công việc sẽ đơn giản và nhanh chóng.

Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp

Tùy từng trường hợp cụ thể mà người nghiên cứu đưa ra những phương pháp kiểm tra thu hồi sản phẩm của gen tái tổ hợp. Nếu là mục đích thiết lập ngân hàng cDNA, ta phải tiến hành các bước sau: Đầu tiên người ta phải tách plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, sau đó, cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme RE loại II và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung vector, còn băng khác có độ dài tương ứng đúng bằng cDNA. Cách kiểm tra lại cDNA đã được cắt bằng cách điện di trên gel agaroza 0,8% và kiểm tra lại độ dài của những băng cDNA thu được. Những đoạn có kích thước khác nhau sẽ di chuyển những khoảng cách khác nhau trên gel.

Nếu sản phẩm của gen tái tổ hợp là protein, enzyme, hormone, vaccine, kháng sinh,... người ta có thể thu nhận sản phẩm bằng phương pháp chiết tách lắng lọc ly tâm kết tủa phân đoạn hoặc trao đổi ion.

Phương pháp lai axit nucleic

Khái niệm đầu dò

Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa.

Đặc điểm của đầu dò

Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn. Đầu dò phải bổ sung các bazơ nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ.

Các loại đầu dò

cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide cũng có thể làm đầu dò. Nếu chuỗi DNA chưa biết trình tự, người ta phải tinh sạch một lượng nhỏ protein tương ứng với DNA đã nghiên cứu và từ đó tổng hợp đầu dò. Còn nếu một phần DNA phải so mốc đã biết thì công việc rất dễ dàng để tổng hợp một đầu dò.

Nguyên tắc của phương pháp lai axit nucleic

Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính khi hạ nhiệt độ từ từ của DNA. Khi tăng nhiệt độ của DNA lên quá nhiệt độ sinh lý (thường ở khoảng 80 đến 95°C), hai sợi đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ của khối DNA đã biến tính cùng với các điều kiện thích hợp khác, các mạch đơn bắt cặp trở lại. Sự bắt cặp chỉ có thể xảy ra khi hai trình tự DNA hoàn toàn bổ sung cho nhau. Tính đặc hiệu cực lớn của phản ứng lai này cho phép bất kỳ trình tự mạch đơn nào cũng tìm gặp mạch bổ sung với nó, mặc dù chúng nằm trong hàng triệu các trình tự DNA và RNA khác nhau. Có thể dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai.

Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA, RNA và DNA, RNA và RNA.

Phương pháp sử dụng kháng thể

Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu, phản ứng kết tủa.

Cách tiến hành

Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein). Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng giữa protein và kháng thể.

Ứng dụng

Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần phải có kháng thể đặc trưng.

Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.

Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc trở lên, ví dụ như vector pBR 322 size 12{ {} rSub { size 8{"322"} } } {} . Trong plasmid pBR 322 size 12{"322"} {} có hai gen kháng thuốc AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng.

Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai.

Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình

Nguyên tắc

Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn lạc đó có chứa gen lạ.

Cách tiến hành

Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa gen lacZ (ví dụ như dãy pUC), một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal (5 brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài môi trường, dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm.

Qua quan sát, ta thấy plasmid không chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase. Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.