Lên men

Khi vắng mặt hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí NADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận chuyển electron do thiếu chất nhận electron từ bên ngoài. Tuy nhiên, NADH tạo thành trong con đường đường phân vẫn cần phải được oxy hoá trở lại thành NAD⁺. Nếu NAD⁺ không được tái tạo việc oxy hoá glyceraldehyde-3-phosphate sẽ không diễn ra và đường phân sẽ ngừng hoạt động. Vì vậy chức năng chủ yếu của lên men là tái sản NAD⁺ cho đường phân. Để khắc phục tình trạng trên nhiều vi sinh vật đã giảm hoặc làm ngừng hoạt tính của enzyme pyruvate dehydrogenase và sử dụng pyruvate hay một trong các chất dẫn xuất của pyruvate như chất nhận electron và hydro nhằm tái oxy hoá NADH trong một quá trình lên men (Hình 9). Ở đây chỉ giới thiệu một số quá trình lên men thường gặp nhất. Trong lên men vi sinh vật cần chú ý hai điểm: 1) NADH được oxy hoá thành NAD⁺ và 2) chất nhận electron thường là pyruvate hoặc một chất dẫn xuất từ pyruvate. Trong lên men cơ chất bị oxy hoá một phần, ATP chỉ được tạo thành bởi phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất và O₂ là không cần thiết.

Nhiều nấm và một số vi khuẩn, tảo và động vật nguyên sinh lên men đường thành etanol và CO₂ trong một quá trình gọi là lên men etylic. Pyruvate bị loại CO₂ thành Acetaldehyd, sau đó Acetaldehyd bị khử thành etanol nhờ sự xúc tác của alcohol-dehydrogenase với NADH là chất cho electron (Hình 10, số 2). Quá trình lên men thứ hai gọi là lên men lactic còn gặp phổ biến hơn. Đây là sự khử Pyruvate thành lactat (Hình 10, số 1). lactic diễn ra ở vi khuẩn (vi khuẩn lactic, Bacillus), tảo (Chlorella), một số mốc nước, động vật nguyên sinh thậm chí ở cả cơ xương của động vật. Các vi sinh vật lên men lactic có thể được chia thành hai nhóm: nhóm lên men lactic đồng hình sử dụng con đường đường phân và trực tiếp khử hầu hết pyruvate thành lactat nhờ sự xúc tác của enzyme lactat dehydrogenase; nhóm lên men lactic dị hình tạo thành một lượng lớn các sản phẩm không phải lactat, trong đó nhiều loài tạo thành lactat, etanol và CO₂ qua con đường phosphorusketolase.

Oxy hóa lại NADH trong lên men. NADH từ đường phân được oxy hóa lại nhờ được dùng để khử pyruvate hay 1 chất dẫn xuất của pyruvate (X). Kết quả là xuất hiện lactat hoặc sản phẩm khử Y. (Theo: Prescott và cs, 2005)

etylic và lên men lactic là hai quá trình lên men rất có ích cho con người. etylic do nấm men được dùng để sản xuất các loại đồ uống có chứa cồn; CO₂ thoát ra từ quá trình lên men này có tác dụng làm nở bột mì. Mặc dù có thể gây hư hỏng thực phẩm nhưng lên men lactic được dùng phổ biến để muối dưa, cà, sản xuất sữa chua, nem chua, ủ chua thức ăn cho gia súc.

Nhiều vi khuẩn, đặc biệt là các cá thể trong họ Enterobacteriaceae có thể chuyển hoá Pyruvate thành acid formic và các sản phẩm khác trong một quá trình đôi khi được gọi là lên men formic (Hình 10, số 5). Nhờ formic - hydroliase (là phức hợp gồm ít nhất hai enzyme) acid formic có thể bị phân giải thành H₂ và CO₂:

HCOOH → CO₂ + H₂

Một số quá trình lên men phổ biến ở vi sinh vật. Để cho đơn giản ở đây chỉ giới thiệu các quá trình lên men Pyruvate; trên thực tế nhiều phân tử hữu cơ khác cũng có thể được lên men. Hầu hết các quá trình lên men này đã được đơn giản hóa bằng cách loại bỏ 1 hoặc nhiều bước và các chất trung gian. (Theo: Prescott và cs, 2005). 1-Vi khuẩn acid lactic (Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus). 2-Nấm men, Zymomonas. 3-Vi khuẩn acid propionic (Propionibacterium). 4-Enterobacter, Serratia, Bacillus. 5-Vi khuẩn đường ruột (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus). 6-Clostridium

Có hai loại lên men formic. acid hỗn hợp cho sản phẩm là etanol và một hỗn hợp các acid đặc biệt là acetic, lactic, succinic và formic (bảng 2).Nếu formic hydroliase có mặt acid formic sẽ bị phân giải thành H₂ và CO₂. Dạng lên men này gặp ở Escherichia, Salmonella, Proteus và một số chi khác. butandiol đặc trưng ở các chi Enterobacter, Serratia, Erwinia và một số loài của Bacillus (Hình 10, số 4). Pyruvate được chuyển hoá thành acetoin, sau đó acetoin bị khử thành 2,3-butandiol với NADH. Một lượng lớn etanol cũng được tạo thành cùng với những lượng nhỏ các acid gặp trong lên men acid hỗn hợp.

Các sản phẩm lên men acid hỗn hợp ở E. coli. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Cân bằng lên men(μM sản phẩm/100μM glucose)
Sinh trưởng acid (pH6)	Sinh trưởng kiềm (pH8)
Ethanol	50	50
Acid formic	2	86
Acid acetic	36	39
Acid lactic	80	70
Acid succinic	11	15
CO2	88	2
H2	75	0,5
Butandiol	0	0

1. Thử nghiệm (test) Voges-Proskauer là một phương pháp so màu dùng phát hiện tiền chất acetoin của butandiol (Hình 10). Thử nghiệm này chỉ dương tính với các vi khuẩn lên men butandiol.
2. Các vi khuẩn lên men acid hỗn hợp tạo thành các sản phẩm acid nhiều hơn 4 lần các sản phẩm trung tính, trong khi các vi khuẩn lên men butandiol tạo thành các sản phẩm trung tính là chủ yếu. Do đó các vi khuẩn lên men acid hỗn hợp acid hoá rất rõ rệt môi trường nuôi cấy. Đây là cơ sở của thử nghiệm đỏ metil (methyl red). Thử nghiệm là dương tính chỉ với lên men acid hỗn hợp vì pH giảm xuống dưới 4,4 và màu của chất chỉ thị chuyển từ vàng sang đỏ.
3. CO₂ và H₂ xuất hiện đẳng lượng do hoạt tính của formic-hydroliase trong lên men acid hỗn hợp. Các vi khuẩn lên men butandiol tạo thành dư thừa CO₂ và tỉ lệ CO₂/H₂ xấp xỉ 5:1.

Các vi khuẩn lên men formic đôi khi tạo thành ATP trong việc tái oxy hoá NADH. Chúng sử dụng Acetyl-CoA để tổng hợp Acetyl-phosphate sau đó nhóm phosphate này được chuyển đến ADP.

Acetyl-CoA + Pi → CoA.SH + Acetyl-P

Acetyl-P + ADP → Acetat + ATP

Các vi sinh vật tiến hành các quá trình lên men khác với các quá trình nói trên. Động vật nguyên sinh và nấm thường lên men đường thành lactat, etanol, glycerol, succinat, format, acetat, butandiol và các sản phẩm bổ sung.

Phản ứng Stickland. Alanin bị oxy hóa thành acetat và glixin được dùng để oxy hóa lại NADH sản ra trong sự phân giải alanin. cũng tạo thành ATP. (Theo: Prescott và cs, 2005)

Các chất không phải đường cũng được lên men bởi vi sinh vật. Chẳng hạn, một số loài của chi Clostridium thường lên men các hỗn hợp acid amin. Các clostridia phân giải protein như các vi khuẩn gây bệnh. C. sporogenes và C. botulinum thực hiện phản ứng Stickland trong đó một acid amin bị oxy hoá trong khi một acid amin thứ hai tác dụng như chất nhận electron. Phản ứng Stickland điển hình là phản ứng trong đó alanin bị oxy hoá và glixin bị khử để tạo thành acetat, CO₂ và NH₃. ATP được sản ra từ Acetyl-P nhờ phosphoryl hoá ở mức độ cơ chất và kiểu lên men này rất thích hợp cho các vi khuẩn khi sinh trưởng trong môi trường kỵ khí giàu protein. Phản ứng Stickland được dùng để oxy hoá một số acid amin như: alanin, leucin, isoleucin, valin, phenylalanin, tryptophan và histamin. Các acid amin khác như glicin, glutamate, threonine, arginin và cả alanin cũng được vi khuẩn lên men nhưng theo cơ chế khác. Ngoài đường và acid amin các acid hữu cơ như acetat, lactat, propionat và citrat cũng được lên men. Một số quá trình lên men nói trên có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế chẳng hạn citrat có thể được chuyển thành diacetyl tạo cho sữa lên men hương vị thơm ngon.