Gene knock-out, knock-in và knock-down

Gene knock-out là một phương pháp được sử dụng làm mất chức năng (hay bất hoạt) một gene đã biết rõ trình tự. Để thực hiện, một đoạn DNA được chèn vào cấu trúc của gene đó. Nễu kỹ thuật này được thực hiện trên các DNA của tế bào gốc trong phôi chuột sẽ giúp tạo ra thế hệ chuột mới mang những gene bất hoạt. Người ta cũng gọi các gene bị biến đổi theo phương pháp này là các gene bị đột biến. Để tìm hiểu kỹ hơn về kỹ thuật này, xin đọc bài về giải Nobel sinh lý học hoặc y học 2007.

Ở đây chỉ tóm tắt lại các bước chính của quy trình knockout gene ở chuột nhắt sử dụng tế bào gốc từ phôi.

Gene cần được biến đổi cấu trúc được gọi là gene định hướng (targeting gene)

1) Tế bào trứng của chuột sau khi được thụ tinh sẽ phát triển thành phôi. Khi các túi phôi (blastocyst) được tạo thành, các tế bào trong túi phôi (inner cells) được lấy ra trước khi chúng gắn vào thành túi phôi. Đây chính là các tế bào gốc của phôi (embryonic stem cells: ES cells). Khi đưa vào môi trường nuôi cấy nhân tạo (canh trường), các tế bào này có thể được biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau.

2) Tạo một véc-tơ (vector) đinh hướng hay "targeting vector":

Vector là một đoạn DNA được "chèn thêm" một đoạn DNA "ngoại lai".

Vector có thể thực hiện chức năng vận chuyển đoạn DNA ngoại lai vào các tế bào khác.

Trong cấu trúc của vector định hướng bao gồm:

+ Đoạn DNA có trình tự tương đồng với gene cần làm thay đổi cấu trúc (homologous DNA),

+ Đoạn DNA được chèn (inserted DNA) sẽ làm thay đổi cấu trúc gene cần biến đổi (gene mục tiêu, gene mục tiêu). Đoạn này mang thêm DNA đánh dấu (marker DNA).

Marker được sử dụng trong trường hợp này là đoạn DNA mã hóa cho enzym neomycin phosphotransferese (NPT) (NPT có khả năng kháng kháng sinh neomycin, kanamycin và những chất tương tự). Gene kháng neomycin (neomycin resistance) được ký hiệu "neo r". Nếu tế bào đã thu nhận đoạn gene ngoại lai nó sẽ đồng thời thu nhận đoạn neo-r và người ta kiểm tra được sự hiện diện của nó trong môi trường có mặt neomycin.

Dùng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phát triển chọn lọc (selective growth media) là phương pháp thông dụng để kiếm tra xem gene đánh dấu (marker) có "nhiễm" được vào tế bào hay không. Trường hợp ngoại lệ đối với gancyclovir vì nó sẽ tiêu diệt các tế bào mang marker tương ứng (Herpes simplex virus thymidine kinase - HSV tk).

3) Đưa vector vào môi trường nuôi tế bào gốc từ phôi với hy vọng các DNA của vector sẽ vào được tế bào (nhiễm gene hay gene transfection) theo cơ chế tái tổ hợp các đoạn tương đồng của DNA. Khi DNA ngoại lai "nhiễm" thành công, đoạn neo r cũng có mặt trong các gene đích (targeted gene). Tất nhiên là chỉ một số lượng rất ít các tế bào thu nhận được các đoạn DNA từ bên ngoài này.

4) Nuôi các tế bào gốc từ phôi có mang mang đoạn neo. Chúng sẽ nhân lên bằng cách gián phân.

5) Sau khi được tiêm vào túi phôi, các tế bào được chọn ở trên sẽ trộn lẫn với khối tế bào trong túi phôi (inner cell mass). Các túi phôi mang khối tế bào pha trộn (mosaic blastocyst) được chuyển vào tử cung chuột mang thai và chúng có thể phát triển thành phôi pha trộn (mosaic embryo).

6) Phôi pha trộn sẽ phát triển và cho ra đời các chuột con mang gene định hướng đã bị biến đổi.

Có thể cho lai các chuột mang "gene đột biến" này với chuột bình thường hoặc giữa các chuột mang gene biến đối với nhau (nếu gene bị biến đổi không dẫn đến mất khả năng sinh sản).

Trong võng mạc của người và các loại linh trưởng có 3 thụ quan (receptor) thị giác tiếp nhận các bước sóng ánh sáng: Bước sóng ngắn (xanh da trời), bước sóng trung bình (màu xanh lá cây) và bước sóng dài (màu đỏ). Ở chuột nhắt và các động vật có vú khác chỉ có hai thụ quan tiếp nhận bước sóng ngắn và trung bình.

Nếu thay một bản sao gene mã hóa cho receptor tiếp nhận sóng trung bình ở chuột nhắt bằng một DNA mã hóa receptor tiếp nhận sóng dài của người thì cả hai receptor này có mặt trong võng mạc. Người ta đã kiên trì tập luyện (và có phần thưởng cho chúng bằng các giọt sữa) thì thấy rằng chuột mang thêm gene cho receptor tiếp nhận sóng dài của người có khả năng phân biệt một màu với hai màu còn lại.

Thí nghiệm thay thế một bản sao bằng một đoạn DNA khác được gọi là "gene knock-in".

Trong trường hợp này người ta sử dụng một đoạn DNA hay RNA có trình tự bổ sung với gene cần tác động hoặc bổ sung với RNA thông tin (mRNA) của nó. Các đoạn này sẽ kết hợp với các gene cần tác động hay các mRNA làm giảm biểu hiện của gene. Căn cứ vào thay đổi của kiểu hình có thể hiểu hơn về chức năng của gene bị tác động. Sử dụng RNA can thiệp kích thước nhỏ (small interfering RN: siRNA) là phương pháp được ứng dụng trong gene knock-down.

Hiện nay kỹ thuật knock-out không chỉ còn giới hạn ở chuột nhắt (mouse) mà được ứng dụng với nhiều sinh vật khác.

Knock-out ở chuột (rat) cũng đã được tiến hành nhưng chưa phổ biến vì khó hơn và tốn kém hơn...

Trong nhiều tài liệu sinh học của ta vẫn dùng thuật ngữ "khảm" để chỉ các cơ thể mang cả gene bình thường và cả gene bị biến đổi. Trong từ điển Anh-Việt (TTKH Xã hội và Nhân Văn, NXB TP Hồ Chí Minh, 2001) dịch là tranh ghép mảnh, đồ khảm, đồ lắp ghép. Như vậy cách dịch này căn cứ vào biểu hiện bên ngoài.

Theo thuật ngữ sinh học (Henderson's Dictionary of biological terms) thì có các trường hợp sau:

Mosaic (1)(n) "disease of plants characterized by mottling of leaves and caused by various virus, e.g. tobacco mosaic, cucumber mosaic". Ở đây căn cứ vào biểu hiện bên ngoài nên ta dùng khảm trong các bệnh khảm thuốc lá, khảm dưa chuột.

(2) organism whose body cells a mixture of two or more different genotypes. Examples are human and other mammalian females, who have one of their chromosomes inactivated at random early in development. Their adult tissues therefore usually contain a mixture of cells containing different active X chromosomes.

Trong trường hợp của knockout ta có nên dùng "pha trộn" để thay cho từ "khảm" được không?

Khi quan sát nhiều chuột mang gene bị knockout chẳng thấy gì khác chuột bình thường. Để biết được chúng có mang gene bị bất hoạt không ta phải xác đinh kiểu gene (genotyping). Các ký hiệu thường dùng để biểu hiện kiểu gene:

Homozygous wild type (+/+): Chuột bình thường, không có allele nào bị biến đổi.

Homozygous null (-/-): Cả hai allele đều bị biến đổi, gene bị bất hoạt hoàn toàn.

Heterozygous (+/-): Một allele còn nguyên vẹn và một allen đã bị biến đổi. Chức năng của gene vẫn có thể bình thường. Đây cũng là các cá thể "bị trộn gene".

* Dioxin receptor knockout

* Estrogen receptor alpha knockout

* Estrogen receptor beta knockout

* Androgen receptor knockout

* Insulin-like growth factor knock-out