Các kỹ thuật cơ bản của cấy truyền phôi

Gây siêu bài noãn

Gây siêu bài noãn hay gây rụng trứng nhiều là một quá trình tác động để một lần động dục buồng trứng bò có nhiều trứng phát triển, chín và rụng đồng thời. Mục đích của quá trình này là thu được nhiều phôi, phôi chất lượng cao. Gây rụng trứng nhiều là khâu đầu tiên mang ý nghĩa quyết định đến các khâu về sau của công nghệ này (giội rửa thu hoạch phôi, cấy chuyển phôi, đông lạnh phôi, v.v…).

Một số hormon thường dùng để gây rụng trứng nhiều là PMSG (Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin còn gọi là HTNC), FSH (Follicle Stimulating Hormone) và HMG (Human Menopausal Gonadotropin). Liều lượng, qui trình sử dụng của mỗi loại hormon phụ thuộc vào đối tượng gia súc. Kết quả gây siêu bài noãn phụ thuộc nhiều yếu tố: giống, thức ăn, nuôi dưỡng, chăm sóc, quản lý, thời tiết, khí hậu, trạng thái sinh lý của con vật, hormon sử dụng…

Gây động dục đồng pha cho bò cái nhận phôi

Gây động dục đồng pha là quá trình kích thích cho cái nhận phôi động dục cùng với thời điểm động dục của cái cho phôi. Đồng pha giữa cái nhận phôi và cái cho phôi còn có nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục ở cái nhận phôi phù hợp với tuổi của phôi. Như vậy, khi tiến hành cấy phôi tươi, cái cho phôi và cái nhận phôi phải đổng thời động dục. Khi cấy phôi đông lạnh, cái nhận phôi đã động dục trước đấy một thòi gian, thường là 7 ngày (đúng với tuổi của phôi).

Sự thay đổi về trạng thái sinh lý của cơ quan sinh dục tương ứng với các pha trong chu kỳ (như: sưng, sung huyết, phân tiết niêm dịch, độ pH niêm dịch, thành phần các chất có trong niêm dịch và sự vận động của cơ quan sinh dục, đặc biệt tử cung) phải phù hợp, tương ứng với trạng thái sinh lý của hợp tử, của phôi ở từng giai đoạn phát triển. Có như vậy mói tạo điều kiện cho phôi thai sống phát triển bình thường trong cơ thể mẹ. Vì lẽ đó, cấy truyền phôi chỉ được tiến hành cho những con nhận có trạng thái sinh lý sinh dục phù hợp với giai đoạn phát triển của phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi. Sự không đồng pha sẽ làm mẹ nhận phôi đào thải phôi, phôi không thể tiếp tục sống, phát triển trong tử cung mẹ nhận. Khi cái nhận phôi động dục đồng thời với cái cho phôi hoặc trạng thái sinh lý sinh dục của nó phù hợp với tuổi phôi, người ta gọi là đồng pha hoàn toàn và lấy số 0 làm biểu tượng. Người ta cũng lấy dấu (+) hoặc (-) đặt trước thời gian cái nhận phôi động dục trước hoặc sau cái cho phôi động dục. Ví dụ + 1 có nghĩa cái nhận phôi động dục trước cái cho phôi 1 ngày; – 1 tức là cái nhận phôi động dục sau 1 ngày, v.v…

Khi cấy phôi, cái nhận phôi và cái cho phôi hoặc tuổi của phôi đồng pha nhau. Sự đồng pha này càng cao thì tỷ lệ có chửa càng cao và ngược lại. Trên thực tế, người ta có thể cho phép bò nhận phôi động dục trước hoặc sau 1 ngày, cá biệt ± 1,5 ngày so với bò cho phôi hoặc tuổi phôi.

Thu hoạch phôi

Bò cho phôi, khi gây rụng trứng nhiều động dục sẽ được phối giống. Sau một thời gian nhất định tùy thuộc chương trình, người ta sẽ giội rửa lấy phôi ra khỏi cơ thể bò đó. Quá trình giội rửa lấy phôi được gọi là thu hoạch phôi. Để giội rửa lấy phôi ra khỏi cơ thể mẹ phải có dụng dịch giội rửa, nuôi phôi và dụng cụ lấy phôi.

Dung dịch giội rửa, nuôi phôi ngoài cơ thể mẹ

Thu hoạch phôi bằng cách giội rửa sừng tử cung hoặc ống dẫn trứng của bò cho phôi. Vì vậy, dung dịch giội rửa, nuôi phôi, bảo quản phôi và điều kiện môi trường khi phôi ở ngoài cơ thể mẹ ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ đậu thai sau khi cấy. Môi trường giội rửa nuôi cấy phải đạt được các mặt như sau. Các yêu cầu về môi trường giội rửa, nuôi cấy phôi

Khi giội rửa thu hoạch phôi, cần phải có một số dụng cụ lấy phôi cỡ 12, 18 hoặc 20G, tùy thuộc vào phương pháp giội rửa và kích thước tử cung của bò cho phôi, dụng cụ này được gọi là foley catheter. Foley catheter cũng thay đổi theo lịch sử phát triển của công nghệ phôi.

Hiện nay tồn tại 2 phương pháp giội rửa thu hoạch phôi, phương pháp phẫu thuật và phương pháp không phẫu thuật. Phương pháp thu phôi không phẫu thuật ở trâu bò được sử dụng rộng rãi. Foley catheter được sử dụng nhiều và có hiệu quả là foley catheter 2 hoặc 3 đường của hãng IMV (Cassou)- Pháp, foley catheter 2 đường (Willy Rush) của hãng Minitub – Đức, của Mỹ, của Úc.

Phương pháp giội rửa, thu hoạch phôi

Có 2 phương pháp giội rửa, thu hoạch phôi là phương pháp phẫu thuật và phương pháp không phẫu thuật. Hiện nay, ở bò, người ta chỉ dùng phương pháp giội rửa không phẫu thuật. Vị trí giội rửa và phương pháp lấy phôi được minh hoạ qua hình dưới. Vị trí của bóng khí trong đường sinh dục bò cái khi giội rửa, thu phôi Phương pháp giội rửa, thu phôi ở tử cung (Elsdel et al, 1976)

Thời gian tiến hành giội rửa lấy phôi theo phương pháp không phẫu thuật thường vào ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau khi phối giống, tốt nhất ngày thứ 7 và 8. Lượng dung dịch cần đưa vào, lấy ra cho một lần giội rửa là 0,5 – 1,0 lít cho 1 bò.

Dung dịch sau khi lấy ra khỏi tử cung có thể được lắng đọng 20 – 30 phút (đựng vào bình hoặc phễu) nhưng cũng có thể đưa vào đĩa petri soi tìm phôi ngay (đựng vào phễu lọc phôi trực tiếp).

Phương pháp soi tìm phôi

Đưa đĩa petri lên kính hiển vi soi nổi (Stereo Microscope) để tìm phôi. Để thấy phôi nhanh, rõ chỉ cần độ phóng đại của kính từ 12 – 24 lần. Nhưng để đánh giá, phân loại chính xác, phôi cần phải được phóng đại > 64 lần.

Để tìm phôi nhanh, không lặp lại nhiều, người kỹ thuật thường tìm theo dạng chữ chi ngang hoặc dọc dựa theo các ô đã chia ở đĩa petri. Khi thấy phôi phải lập tức hút chuyển ngay sang dung dịch nuôi cấy, vô trùng.

Khi soi tìm phôi dễ bị nhầm lẫn, bỏ sót vì vậy cần phải lặp lại 2 – 3 lần trước khi chuyển cho người khác soi tìm lại.

Đánh giá phân loại phôi

Phôi thu được vào ngày thứ 7 sau khi phối thường là phôi dâu và phôi nang. Nếu vào những ngày này, phôi chỉ có 2, 4, 8 tế bào, phôi đó là phôi chậm phát triển. Sự chậm phát triển của phôi do những nguyên nhân sau:

– Phôi bị chết.

– Phôi bị thoái hóa trong quá trình phát triển.

– Sự rụng trứng bị chậm lại, thường 2 – 4 ngày.

Để đánh giá phân loại được phôi tốt, xấu trong ngày thu hoạch người ta căn cứ vào một số mặt sau đây:

Hình thái chung của phôi

Kích thước của phôi; bình thường phôi có kích thước 100  – 200µ.

Hình dáng phôi: phôi có hình cầu dẹt; nhìn qua kính hiển vi phôi có hình tròn, giới hạn phôi là màng trong suốt (Zona pellucida)

Mức độ phân chia tế bào

– Số lượng phôi bào: thường số lượng này phụ thuộc vào giai đoạn phát triển, đầu tiên sau khi trứng, tinh trùng gặp nhau tạo hợp tử 1 tế bào. Ngay sau đó, hợp tử phân chia cho phôi 2, 4, 8, 16 tế bào, tiếp đến phôi dâu, phôi nang ở các giai đoạn khác nhau.

– Độ tập trung, phân tán và mối liên kết của các tế bào phôi. Số lượng tế bào tách rời nói lên mối liên kết lỏng lẻo của các phôi bào.

Màu sắc của tế bào

Màu sắc có liên quan đến mức độ sống, chết hay thoái hóa của các tế bào; mức độ tập trung hoặc phân tán của mầm phôi; mức độ tổn thương và mảnh vụn vỡ của tế bào; những túi nước v.v…

Từ những căn cứ trên, có 2 quan điểm đánh giá phân loại phôi được đưa ra để áp dụng: một là dựa vào giai đoạn phát triển của phôi, hai là dựa vào mức độ tốt, xấu của phôi. Hai quan điểm này được sự đổng tình của đông đảo các nhà khoa học. Các giai đoạn phát triển của phôi và mức độ tốt xấu của nó được minh hoạ ở các hình, bảng sau đây: Phân loại chất lượng phôi bò Các giai đoạn phát triển của phôi

1. Phôi 1 tế bà0  4. Phôi 8 tế bào  7. Phôi nang sớm 2. Phôi 2 tế bào 5. Phôi 16 tế bào 8. Phôi nang 3. Phôi 4 tế bào 6. Phôi dâu già Phôi bò thu hoạch lúc 7 ngày sau phối tinh

1. Phôi dâu già (rất tốt) 4. Phôi nang (tốt) 2. Phôi nang sớm (rất tốt) 5. Phôi nang trương nở (rất tốt) 3. Phôi nang sớm (trung bình) 6. Phôi nang trương nở (rất tốt)

Sự phân loại trên đây mang tính chất tương đối bởi vì nó phụ thuộc vào người kỹ thuật (trình độ, kinh nghiệm của người đánh giá). Do đó, đôi khi có những đánh giá sai lệch.

Sau khi đánh giá, phân loại, phôi được hút vào cọng rạ để đi cấy ngay gọi là cấy chuyển phôi tươi. Lúc này trên cọng rạ chỉ cần ghi (đánh dấu) loại phôi, chất lượng phôi, giống phôi để người kỹ thuật chọn bò nhận phôi cho phù hợp. Nếu cần đông lạnh, bảo quản, phôi mới được hút vào cọng rạ. Trên cọng rạ và nút phải ghi được một số thông tin sau:

– Ngày lấy phôi, địa điểm lấy phôi (cơ quan lấy phôi)

– Giống bò cho phôi, số hiệu bò cho phôi và đực giống phối giống

– Số lượng phôi, chất lượng phôi

– Phương pháp đông lạnh.

Cấy truyền phôi

Khi đã có phôi, có bò nhận phôi, người kỹ thuật phải tiến hành cấy truyền phôi (phải đưa phôi đang ở bên ngoài vào cơ thể bò nhận phôi). Nguyên tắc của cấy truyền phôi là phôi được lấy ra ở vị trí nào trong đường sinh dục con cái cho phôi thì lúc cấy chuyển phải đưa phôi vào đúng vị trí đó ở con cái nhận. Nếu giội rửa lấy phôi ở ống dẫn trứng phải cấy trả phôi đó vào ống dẫn trứng. Còn phôi được giội rửa lấy ra ở chóp sừng tử cung hoặc sừng tử cung phải cấy chuyển nó vào sừng hoặc chóp sừng tử cung. Như vậy, có hai vị trí để cấy truyền phôi: ống dẫn trứng và sừng tử cung (đỉnh chóp và sừng). Ngày nay, thường cấy phôi vào nửa sừng phía trên hoặc chóp sừng tử cung. Có 2 phương pháp đưa phôi vào tử cung bò nhận: phẫu thuật và không phẫu thuật. Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng. Cấy phôi bằng phương pháp phẫu thuật, tỷ lệ đậu thai cao hơn nhưng phức tạp và khó áp dụng ở các cơ sở. Phương pháp cấy phôi không phẫu thuật tuy tỷ lệ đậu thai có thấp hơn chút ít nhưng hiện nay được sử dụng nhiều hơn trong sản xuất. Phương pháp này đơn giản, tiện lợi, dễ áp dụng, đồng thời nếu kỹ thuật viên tay nghề giỏi sẽ cho tỷ lệ đậu thai không thua kém phương pháp phẫu thuật.

Tỷ lệ đậu thai sau khi cấy phụ thuộc nhiều yếu tố (chất lượng phôi, dung dịch nuôi cấy phôi, sự đồng pha ở cái nhận phôi, trạng thái sinh lý, sức khoẻ của con vật, điều kiện khí hậu, môi trường sinh thái, thức ăn, nuôi dưỡng, kỹ thuật thao tác…). Tỷ lệ này thường dao động 0 – 100%. Hiện nay, tỷ lệ đậu thai bình quân ở các nước có nền chăn nuôi tiên tiến như: Mỹ, Canada, New Zealand là 65 – 75% đối với phôi tươi và 50 -60% đối với phôi đông lạnh. Tỷ lệ này ở Nhật tính cho toàn quốc là: 50 – 55% phôi tươi; 40 – 50% phôi đông lạnh. Ở các nước khi mới triển khai công nghệ này, tỷ lệ đậu thai sau khi cấy kém hơn đạt 25 – 35% đối với phôi tươi, 20 – 30% đối với phôi đông lạnh. Cho đến nay, tỷ lệ này đã được cải thiện, đậu thai sau khi cấy phôi tươi là 40 – 60% và 35 – 45% ở phôi đông lạnh.

2 – 3 tháng sau khi cấy chuyển phôi, bò nhận cần được khám thai. Khi khám thai cho bò nhận phôi cần chú ý 3 mặt sau đây:

♦ Bò sau khi cấy phôi 10 – 12 ngày cần theo dõi sự xuất hiện động dục vì lúc này ứng với ngày 18 – 22 của chu kỳ động dục. Tiến hành quan sát 2 – 3 lần trong các ngày theo dõi. Nếu bò xuất hiện triệu chứng động dục, chỉ ghi chép, không phối giống vì có thể là bò biểu hiện động dục giả. Bò sẽ được phối giống nếu động dục xuất hiện ở chu kỳ sau.

♦ Có thể xác định khả năng có chửa qua việc định lượng hàm lượng Progesteron trong máu hoặc sữa ở ngày thứ 21 hoặc 23 của chu kỳ (tức sau 2 tuần kể từ khi cấy phôi), nếu hàm lượng Progesteron trong máu cao hơn 2,5 ng/ml có nghĩa bò nhận đã có chửa. Độ chính xác của phương pháp là 85% nếu bò có chửa và 98% nếu bò không có chửa. Việc định lượng Progesteron có thể được lặp lại sau 3 tuần.

♦ Phương pháp chẩn đoán có chửa chính xác nhất là khám qua trực tràng sau 50 – 60 ngày cấy phôi đối với kỹ thuật viên giỏi và sau 90 ngày (ba tháng) khám kết quả chính xác 100% đối với các kỹ thuật viên khác.

Tỷ lệ đậu thai sau khi cấy chuyển phôi cho bò nhận chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như đã đề cập ở trên. Giai đoạn phát triển của phôi ứng với thời gian của chu kỳ động dục ở bò nhận khi cấy phôi