Các đặc điểm sinh hóa

Xét nghiệm oxidaza

Mục đích: phân biệt các nhóm vi khuản dựa trên hoạt tính cytochrom oxidaza

        Pha dung dịch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD) 1% trong nước, bảo quản trong lọ màu tối ở 4 °C, sử dụng trong 2 tuần.

        Đặt một miếng giấy lọc trong nắp hộp Petri sạch, nhỏ dung dịch TPPDD 1% lên trên miếng giấy lọc sao cho vừa đủ ẩm, không để quá ướt.

        Dùng que cấy có đầu que làm bằng sợi platin hay dùng đũa thủy tinh (không dùng đầu que cấy bằng sợi kim loại sắt, niken...) lấy một ít vi khuẩn đã hoạt hoá (18-24 giờ) bôi lên miếng giấy lọc.

        Sau 10 giây nếu vi khuẩn chuyển sang màu hồng tức là có oxydaza dương tính; nếu sau 60 giây mới chuyển màu là oxydaza âm tính.

        Chú ý: nếu dung dịch đã tự chuyển sang màu hồng rồi thì không được sử dụng. Nếu giấy lọc quá ướt sẽ cản trở khuẩn lạc tiếp xúc với không khí nên chuyển màu chậm, tạo nên âm tính giả.

Xét nghiệm catalaza

Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H₂O₂ của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalaza.

        Chuẩn bị dung dịch H­₂O₂  nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính.

        Dùng đầu que cấy platin lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) trộn vào giọt H₂O₂ trên phiến kính.

        Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính.

        Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H₂O₂ lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự.

Hình 3.1.         Phản ứng sủi bọt khi tiếp xúc với dung dịch H₂O₂ của vi khuẩn có catalaza dương tính.

 

Khả năng lên men/ôxy hóa glucoza

Có thể dùng một trong hai môi trường sau để làm thí nghiệm

        Môi trường I:

Pepton                               2 g

NaCl                                   5 g

K₂HPO₄                              0,2 g

Glucoza                             10 g

Thạch                                 6 g

Dung dịch BTB 1%              3 ml    (pha trong một ít cồn 95%, sau đó mới thêm nước để thành dung dịch 1%)

Nước cất                            1000 ml.

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 ⁰C trong 20 phút.

        Môi trường II:

NH₄H₂PO₄                              0,5 g

K₂HPO₄                                  0,5 g

Cao men                                0,5 g

Glucoza                                 10 g

Thạch                                     5-6 g

Dung dịch BTB 1%                  3 ml   (pha như trên)

Nước cất                                1000 ml

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào ống nghiệm và khử trùng như trên.

        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 h) cấy chích sâu vào môi trường bằng que cấy thẳng (mỗi chủng vi khuẩn cấy vào 4 ống). Bịt kín 2 ống nút bông bằng vaselin-paraffin (lấy vaselin làm chảy ra, thêm 1/3 dầu paraffin) để cách ly với không khí. Ngoài ra lấy thêm 2 ống không cấy vi khuẩn làm đối chứng. Theo dõi kết quả sau 1,2,3,7 và 14 ngày.

        Kết quả: - Nếu chỉ có ống không bịt kín sinh axit (chuyển màu vàng)

tức là vi khuẩn thuộc dạng ôxy hóa.

- Nếu cả ống không bịt và ống bịt kín đều sinh axit (chuyển màu vàng) tức là vi khuẩn thuộc dạng lên men.

 

Khả năng lên men đường, rượu

     Môi trường:

Cao thịt                                   3 g

Pepton                                    10 g

NaCl                                        5 g

Chất chỉ thị màu Andrade*       10 ml

(hay dung dịch Xanh bromophenol 0,2%)

Nước cất                                  thêm đến 1000 ml

        Bổ sung đường với nồng độ 0,5%. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 1ml.

        Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO₂ sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 121 ⁰C. Đường arabinoza, xyloza, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường.

* Cách pha chất chỉ thị màu Andrade:        

                  Fuchsin axit                  0,5 g

           NaOH 1M                  16 ml

               Nước cất                   100 ml

Nếu dung dịch có màu hồng, dùng NaOH 0,1 M (1-2 ml) để trung hòa cho đến khi mất màu.

Xa nh bromophenol (BPB): 

2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml.

        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 ⁰C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày

        Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) thì chất chỉ thị Andrade sẽ chuyển màu đỏ, chất chỉ thị BPB sẽ chuyển màu vàng lục.

Có thể làm cách khác như sau:

        Với vi khuẩn nói chung dùng môi trường I (xem mục 3.3), thay glucoza các đường khác hay rượu (nồng độ 1).

        Với vi khuẩn sinh bào tử dùng môi trường sau:

(NH₄)₂HPO₄                                 1 g

KCl                                               0,2 g

MgSO₄                                          0,2 g

Cao men                                       0,2 g

Thạch                                            5-6 g

Đường hay rượu                            10 g

Nước cất                                       1000 ml

Dung dịch BTB 0,04%                    15 ml

pH = 7,0-7,2.

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 112 ⁰C trong 30 phút.

        Với vi khuẩn lactic dùng môi trường sau:

Pepton                                            5 g

Cao thịt                                           5 g

Cao men                                          5 g

Tween 80                                         0,5 ml

Thạch                                               5-6 g

Nước cất (hay nước máy)                 1000 ml

Dung dịch BTB 1,6%                          1,4 ml

pH = 6,8-7,0.

Phân môi trường vào ống nghiệm, khử trùng tại 112 ⁰C trong 30 phút.

        Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá (18-24 giờ) cấy trích sâu vào môi trường thạch, đặt ở nhiệt độ thích hợp và quan sát sau 1,3,5 ngày.

        Nếu chỉ thị màu biến vàng là vi khuẩn có khả năng lên men sinh axit (phản ứng dương tính); nếu vẫn giữ màu lam là phản ứng âm tính.

 

Phản ứng M.R. (Đỏ Methyl - Methyl Red)

        Môi trường:

Pepton                                              5 g

Glucoza                                            5 g

K₂HPO₄ hoặc_­  NaCl                          5 g

Nước cất                                          1000 ml.

pH = 7,0 - 7,2.

Phân môi trường vào ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 115 ⁰C trong 30 phút.

        Thuốc thử:

Đỏ Methyl                                         0,1 g

Etanol 95%                                       300 ml

Nước cất                                           200 ml.

        Cấy vi khuẩn vào môi trường (lặp lại 2 lần), đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày (nếu kết quả âm tính cần kéo dài thêm thời gian). Với Vi khuẩn đường ruột thuộc họ Enterobacteriaceae, đặt ống nuôi cấy ở 37 ⁰C và kiểm tra sau 4 ngày.

        Nhỏ 1 giọt thuốc thử vào dịch nuôi cấy, nếu chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính (màu đỏ ở pH 4,4; màu vàng ở pH 6,0).

Hình 3.2. Chất chỉ thị đỏ methyl chuyển màu khi tiếp xúc

với dịch nuôi cấy vi khuẩn lên men đường.

 

Phản ứng  V.P. (Voges-Proskauer)

        Môi trường: xem phần 3.5.

        Thuốc thử:      

Creatin                 0,3% (hoặc để nguyên dạng tinh thể)

                    NaOH                 40%

        Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 2-6 ngày.

        Bổ sung NaOH 40 (bằng thể tích dịch nuôi cấy), sau đó nhỏ một ít dung dịch creatin (hoặc thêm một ít tinh thể), đợi khoảng 10 phút (có khi lâu hơn). Nếu dịch thể chuyển màu đỏ là phản ứng dương tính.

Cách