Một số thành tựu trong lĩnh vực tạo động vật chuyển gen

Vào năm 1982, Palmiter và Brinster đã thành công trong việc tạo ra động vật chuyển gen đầu tiên trên thế giới, bằng cách chuyển gen của loài chuột này sang phôi loài chuột khác. Gen chuyển đã biểu hiện ở chuột chuyển gen và các thế hệ con cháu của chúng. Hai nhà khoa học này đã nhận được giải thưởng Charles Leopold Mayer, giải thưởng cao quí nhất của Viện Hàn lâm khoa học Pháp vào năm 1994.

Palmiter và Brinster đã chuyển một gen ngoại lai vào trứng chuột thụ tinh. Sau đó cấy các trứng này vào chuột mẹ thay thế và đã chứng minh được rằng gen chuyển hoạt động  chức năng trong một số chuột con sinh ra. Nhân giống chuột thế hệ con, các nhà khoa học đã cho thấy gen chuyển có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác theo qui luật di truyền Mendel. Với kỹ thuật chuyển gen, Palmiter và Brinster tin tưởng rằng công việc này sẽ làm sáng tỏ vấn đề thông tin trong bản “thiết kế“ di truyền của chúng ta không được mã hoá trong các cơ thể sống như thế nào và các gen hoạt động trong quá trình phát triển bình thường cũng như trong trạng thái bệnh tật ra làm sao. Việc tạo ra chuột chuyển gen là một định hướng quan trọng trong nghiên cứu liệu pháp gen để điều trị các rối loạn gây nên bởi các lỗi của mã di truyền.

Palmiter và Brinster đã hiểu được cơ chế tế bào đọc mã di truyền và dịch các thông tin đó thành các cấu trúc sinh học. Kỹ thuật chuyển gen mà họ sử dụng dựa trên cơ sở là gen có hai phần chính: vùng mã hóa prtein và vùng điều hòa hoạt động của gen. Một gen ngoại lai có nguồn gốc từ cơ thể khác được nối với một vùng kiểm tra đóng-mở (on-off) và chịu tác động của vùng này. Palmiter và Brinster đã tiến hành sử dụng công tắc mở  là promoter MT (metallothionein). Promoter MT hoạt hóa bởi các ion kim loại đồng, kẽm và catmi, được nối với gen mã hoá enzyme thymidine kinase. Tổ hợp gen này được đưa vào trứng chuột vừa mới thụ tinh. Các nhà khoa học đã thấy rằng, bình thường ion catmi có tác dụng mở (turn on) gen MT, nhưng bây giờ nó mở gen thymidine kinase khi ở trong phôi chuột. Bằng cách tương tự, promoter MT được nối với gen hormone sinh trưởng chuột cống và sau đó chuyển vào chuột nhắt. Kết quả là các chuột nhắt “siêu hạng“ có kích thước lớn hơn chuột bình thường nhiều lần đã ra đời.

Chuột chuyển gen đã cung cấp cho Palmiter và Brinster phương pháp để kiểm tra các mô hình thí nghiệm và điều trị bệnh.

Cho đến nay hàng trăm gen khác nhau đã được đưa vào các dòng chuột khác nhau và kết quả là hàng trăm dòng chuột chuyển gen đã được tạo ra và được phân tích. Các nghiên cứu này đã góp phần cung cấp các hiểu biết về sự điều hòa hoạt động của gen, sự phát triển khối u, tính đặc hiệu của miễn dịch, di truyền học phân tử của sự phát triển và các quá trình sinh học cơ bản khác. Các mô hình chuột chuyển gen điều trị các bệnh như ung thư, bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm, tiểu đường... cũng đã được nghiên cứu. Chuột chuyển gen còn được sử dụng để sản xuất các protein quí hiếm thông qua tuyến sữa và nước tiểu.

DNA có thể được đưa vào chuột nhờ vector retrovirus bằng cách  nhiễm vào các tế bào ở giai đoạn phôi sớm trước khi cấy vào con cái nhận; vi tiêm vào tiền nhân đực của trứng đã thụ tinh và đưa các tế bào gốc phôi đã thao tác di truyền vào phôi đang phát triển ở giai đoạn sớm trước khi cấy vào con cái nhận.

Các nghiên cứu này đã được mở rộng áp dụng trên các đối tượng khác như thỏ, gà, cá, cừu, lợn, trâu bò, dê...

Thỏ đã được sử dụng làm mô hình thực nghiệm trong các thí nghiệm chuyển gen. Việc tạo ra thỏ chuyển gen thành công đã được công  bố vào năm 1985 với gen chuyển là hormone sinh trưởng có cấu trúc MT-hGH (Hammer, 1985;  Brem, 1985). Tỉ lệ các hợp tử thỏ bị thoái hoá do vi tiêm là dưới 10% (Ross,1988). Khả năng phát triển của các phôi đã vi tiêm trước khi chuyển ghép hợp tử là thấp hơn đáng kể so với các phôi đối chứng.

Hiện nay thỏ là đối tượng chuyển gen nhằm mục đích tạo ra protein quí sử dụng trong y dược thông qua tuyến sữa bởi các lý do sau đây:

- Giá phôi thỏ thấp nên có thể tạo ra một lượng lớn thỏ chuyển gen. Ðiều này đã cung cấp cho các nhà nghiên cứu tăng đáng kể khả năng tạo ra được một hoặc vài dòng thỏ chuyển gen sản xuất ra protein hoạt động sinh học với số lượng đầy đủ.

- Thời gian mang thai của thỏ ngắn và thành thục sinh dục nhanh vì vậy cho phép tạo ra dòng thỏ chuyển gen nhanh hơn so với các động vật chuyển gen khác như dê, cừu hoặc bò...

- Giá sản xuất thấp.

- Về mặt di truyền, thỏ gần với người hơn bất kỳ động vật cho sữa nào khác do vậy nó là mô hình được chọn cho việc sản xuất các protein chữa bệnh ở người đặc biệt là các protein phức tạp.

- Không truyền các bệnh nghiệm trọng do virus gây ra cho người.

- Một thỏ cái có thể tiết một lượng sữa lên đến 250ml sữa mỗi ngày. Trong qui trình chuẩn, mỗi ngày chỉ có 100-150ml sữa được lấy từ một thỏ cái điển hình, tương đương với 15 lít mỗi năm đối với một thỏ cái.

- Lượng protein tái tổ hợp trong sữa thỏ chuyển gen biến đổi từ 1-10g trong một lít.

Các loại protein có thể được sản xuất trong sữa thỏ là các kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody), vaccin...  

Vào năm 2001, Eduardo Kac, giáo sư thuộc Học viện Nghệ thuật Chicago, Mỹ đã kết hợp với các nhà Di truyền học Pháp đã tạo một con thỏ chuyển gen có khả năng phát ra ánh sáng màu lục ở trong tối bằng cách vi tiêm gen mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây có nguồn gốc từ sứa vào hợp tử thỏ (Hình 2). Ðây là hướng nghiên cứu mới phục vụ cho mục đích nghệ thuật. “Nó là một vật để cho hoạ sĩ thí nghiệm trên nền của khung vẽ và hoàn toàn khác với thí nghiệm để tạo ra một sự sống“. Nhiều nhà nghệ thuật khác đang nghiên cứu Công nghệ Sinh học và ý nghĩa xã hội của nó mà không nhằm mục đích tạo ra động vật chuyển gen.

Năm 1985, Hammer và cộng sự đã công bố tạo được lợn chuyển gen GH bằng phương pháp giống như đã được sử dụng để tạo ra chuột “khổng lồ“ từ năm 1982.

Khác với chuột, các hợp tử của lợn phải được ly tâm để nhìn thấy tiền nhân. Sau khi ly tâm, khoảng 50% hợp tử phát triển in vivo đến giai đoạn phôi dâu (morula) hoặc phôi nang (blastocyst). Các hợp tử vi tiêm, 10 - 20% phát triển đến các giai đoạn phôi khác nhau. Trong số các hợp tử vi tiêm thì 5,6 - 11% số hợp tử đã phát triển và tạo thành lợn con. Tỉ lệ hợp nhất gen ngoại lai vào DNA của con chủ là khoảng 10%. Các gen hormone sinh trưởng sử dụng trong các thí nghiệm đầu tiên đã cho tỉ lệ biểu hiện 50%. Sự di truyền Mendel đơn giản đã được chứng minh với các dòng tế bào mầm được chuyển gen. Mức độ biểu hiện được duy trì trong những lần sinh sản tiếp theo. Cấu trúc và biểu hiện của các gen chuyển đã được nhiều tác giả công bố.

Các gen ngoại lai được sử dụng để chuyển vào lợn là mMT-hGH (mouse methallothionein-human growth hormone), mMT-bGH (mouse methallothionein-bovin growth hormone), mMT-pGH (mouse methallothionein-porcine growth hormone), PRL-bGH (prolactin-bovin growth hormone), Alb-hGRF (albumin-human growth hormone releasing factor), mMT-hiGF1 (methallothionein-human insulin like growth factor 1). Lợn chuyển gen mMT- hGRF (mouse methallothionein-human growth hormone releasing factor)  cho tỉ lệ biểu hiện 29%. Lợn chuyển gen mMT - hGH và mMT - bGH cho tỉ lệ biểu hiện tới 61%. Số lượng những bản gen lạ tìm thấy ở DNA genome của con chủ là rất khác nhau, từ 1 - 500 bản sao trong một tế bào đối với lợn chuyển gen mMT-hGH, 1-28 đối với mMT-bGH, 1-15 đối với mMT-pGH  và 10 đối với PRL-bGH.

Những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng sinh lý của sự biểu hiện gen lạ cho thấy có sự tăng hormone sinh trưởng ở lợn chuyển gen hGH và bGH. Sự tăng hormone đó làm thay đổi sinh lý của cơ thể động vật. Người ta thấy có sự phân phối lại trọng lượng giữa các thành phần của vật nuôi như cơ, da, xương và các bộ phận khác. Lợn chuyển gen mMT - bGH thì giảm độ ngon nhưng tăng trọng lượng cơ thể.

Ðối với cừu khi vi tiêm không cần thiết phải ly tâm phôi để nhìn thấy tiền nhân. Khả năng phát triển in vivo của hợp tử cừu vi tiêm (10%) và không vi tiêm (26%) bằng một nửa phôi lợn sau khi xử lý tương tự. Sau 7 ngày nuôi cấy in vivo các hợp tử cừu không vi tiêm, Rexroad và Wall (1987) đã quan sát được tỉ lệ phát triển là 86%. Một thí nghiệm nuôi cấy in vivo trong 5 giờ đã giảm tỉ lệ phát triển này xuống còn 65% và sau khi tiêm một dung dịch đệm đã giảm xuống đến 42%. Sau khi vi tiêm dung dịch DNA, 19% số hợp tử phát triển đến giai đoạn 32 tế bào. Ở những thí nghiệm đầu tiên, tỉ lệ hợp nhất là khoảng 1% trong khi tỉ lệ sống sót của phôi vi tiêm đến con non là 7% và 6,2% (theo Brem, 1991).

Các gen GH đã được sử dụng để chuyển vào cừu. Ngoài các gen GH như đã dùng để chuyển vào lợn (mMT-hGH, mMT-bGH, PRL-bGH , mMT-hGRF), người ta còn sử dụng các gen sMT-sGH 5(sheep methallothionein-sheep growth hormone 5), sMT-sGH 9(sheep methallothionein-sheep growth hormone 9). Các kết quả thu được không được tốt như ở lợn. Chỉ có cừu chuyển gen sMT-sGH cho tỉ lệ mỡ thấp hơn so với cừu đối chứng. Người ta cho rằng các tổ hợp MT-gen chuyển không có khả năng cảm ứng với các kim loại nặng khi cừu ăn vào. Mặt khác cũng có thể do ở cừu thiếu các yếu tố nội bào thích hợp cho sự cảm ứng, cho sự tái sắp xếp các gen chuyển và cho sự tích hợp gen chuyển vào genome của tế bào chủ ở các vị trí thuận lợi. Bên cạnh các gen hormone sinh trưởng, một số các gen khác cũng đã được chuyển vào cừu như gen mã hoá yếu tố đông máu IX , gen α1-antitripsin, gen cysE, gen cysK.

Một thử nghiệm cũng đã được thực hiện để tạo ra gen chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm vào hợp tử đã ly tâm (Armstrong và cộng sự, 1987; Fabricant và cộng sự, 1987). Tỉ lệ dê con cho sữa chuyển gen sinh ra là 5 - 10%. Một số protein dược phẩm đã được biểu hiện ở sữa dê chuyển gen .

Giống như lợn, tiền nhân của hợp tử bò được thấy rõ nhờ ly tâm. Lohse, robl và First (1985) đã tiêm gen thymidine - kinase vào hợp tử bò và đã thấy rằng, 24 giờ sau khi tiêm khoảng 30% phôi có thymidine - kinase. Roschlaw và cộng sự (1988) đã vi tiêm 513 hợp tử bò với 3 cấu trúc gen khác nhau có nguồn gốc từ virus và đã tìm thấy DNA ngoại lai trong 14 phôi. Loskutoff và cộng sự (1986) đã thu được 3 thai sau khi tiêm 72 hợp tử và 17 phôi ở giai đoạn 2 tế bào. Mc. Evoy và cộng sự (1987) đã thu được 4 thai sau khi chuyển 43 hợp tử vi tiêm và 8 trứng ở giai đoạn 2 tế bào vào 17 thể nhận. Church, Mc. Rae và Mc. Whir (1986) đã tiêm 852 hợp tử bò với gen alpha-fetoprotein và thấy 4 phôi có sự hợp nhất gen trong số 111 phôi phát triển.

Trong thí nghiệm vi tiêm hợp tử bò, tỉ lệ bê con sinh ra từ phôi vi tiêm là 19,9%, tương ứng với các phôi đối chứng không vi tiêm là 42,8%. Theo Church và cộng sự (1987) thì 7 trong 126 bê con vi tiêm (5,6%) DNA ngoại lai đã hợp nhất với DNA genome. Biery, Bondioli và Mayo (1988) đã đạt được tỉ lệ hợp nhất từ 0,22 - 1,76% số hợp tử vi tiêm.

Gà chuyển gen được phát triển nhằm các mục đích chủ yếu: phát triển, cải tiến các phương pháp và kỹ thuật thí nghiệm; sản xuất dược phẩm và các protein khác trong trứng để sử dụng trong y học người và vật nuôi; nhận biết và khai thác các tính trạng sinh học có lợi cho sản xuất thịt gia cầm; nghiên cứu sự phát triển phôi.

Như chúng ta đã biết, nguyên tắc của tinh trùng trong quá trình thụ tinh là chuyển genome đơn bội của mình vào trứng để tạo thành hợp tử. Khả năng này đã được khai thác như là một  chiến lược đổi mới sự phân phát DNA ngoại lai đối với sự sinh sản của động vật chuyển gen. Bằng phương pháp vi tiêm tinh trùng mang plasmid tái tổ hợp một cách trực tiếp vào tế bào chất của trứng (intracytoplasmic sperm injection =ICSI), các nhà khoa học thuộc Trường Ðại học Khoa học Sức khoẻ Oregon, Mỹ đã tạo ra các phôi biểu hiện gen chuyển ở khỉ rhesus. Plasmid tái tổ hợp được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm gen marker mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây GFP (green fluoenscent protein) kết hợp với promoter CMV (cytomegalovirus). Gen GFP được tách chiết lần đầu tiên từ các con sứa có màu sắc sặc sỡ và là gen  được các nhà nghiên cứu ưa chuộng vì khi GFP được tạo ra với số lượng đầy đủ chúng sẽ phát ra ánh sáng màu xanh. Các phôi biểu hiện GFP đã được tạo ra bằng phương pháp ICSI mặc dù không thông qua thụ tinh nhân tạo. Tinh trùng của khỉ rhesus vẫn mang plasmid tái tổ hợp sau khi vi tiêm vào trong khỉ thành thục sinh dục. Sự biểu hiện GFP thể khảm đã được phát hiện ở giai đoạn 1-4 tế bào. Số lượng tế bào phôi và tỉ lệ % phôi biểu hiện ngày càng tăng lên trong sự phát sinh phôi cho tới giai đoạn túi phôi. Cả khối tế bào phôi bên trong và ngoại phôi bì dinh dưỡng (trophectoderm) đều cho thấy huỳnh quang màu xanh của GFP. Từ 7 phôi chuyển gen đã tạo thành 3 khỉ con: một cặp sinh đôi bình thường gồm một đực và một cái bị sinh thiếu 35 ngày và đã chết yểu; một con đực sức khoẻ tốt sinh đúng thời hạn được đặt tên là “George“. Kết quả này chứng tỏ rằng với phương pháp ICSI, tinh trùng khỉ mang DNA ngoại lai vẫn duy trì khả  năng sinh sản của chúng một cách bình thường. Tuy nhiên, về mặt lý thuyết các nhà khoa học vẫn lo lắng rằng phương pháp này có thể truyền thêm vật chất di truyền cho thế hệ sau do nhiễm từ bên ngoài vào một cách tình cờ (ví dụ như nhiễm virus và vi khuẩn).

Bằng phương pháp chuyển gen nhờ vector là virus, các nhà khoa học thuộc Trường Ðại học Khoa học Sức khoẻ Oregon, Mỹ cũng đã tạo ra được một một chú khỉ rhesus chuyển gen khác có tên là ANDi (inserted DNA=iDNA nhưng được đảo ngược) được sinh vào ngày 2 tháng 10 năm 2000. Ở đây, một vector virus không lây nhiễm đã được sử dụng để mang gen GFP vào trứng của khỉ mẹ một cách trực tiếp. Sau đó vector virus này bám vào bề mặt của trứng và bị mất đi còn gen GFP tiếp tục con đường của nó để đi vào nhiễm sắc thể của mẹ. Các trứng chuyển gen này sẽ được thụ tinh nhân tạo. Phôi thụ tinh thu được sẽ được đưa vào các con mẹ thay thế.

Các nhà nghiên cứu đã chuyển gen GFP vào 224 trứng. Sau khi các trứng thụ tinh tạo ra 40 phôi và hình thành nên 5 bào thai. Trong đó chỉ có 3 bào thai sống sót và cuối cùng duy nhất chỉ một chú khỉ chuyển gen thành công là ANDi. Tuy nhiên ANDi không phát sáng trong tối (Hình 4).

Với phương pháp này các nhà khoa học hy vọng sẽ lấp được  chỗ trống khoa học giữa chuột chuyển gen và người.  Kết quả thu được đã cung cấp một công cụ nghiên cứu đầy tiềm năng và hữu hiệu để khám phá nguyên nhân của các bệnh như ung thư, Parkinson, Alzheimer, tiểu đường, tim mạch, các bệnh về trí tụê... Nghiên cứu này cũng cho thấy một bước mới trong hướng liệu pháp gen dòng mầm (germ line genetic therapies). Các gen xác định các vấn đề di truyền có thể được đưa một cách trực tiếp vào trứng người chưa thụ tinh của cơ thể mẹ được biết mang các gen bệnh nhất định. Cho đến nay tất cả các nghiên cứu liệu pháp gen của người đã được giới hạn để tập trung vào các mục tiêu tế bào ở đó các gen được đưa vào không trở thành một bộ phận của genome.

Theo Tổ chức Sức khoẻ Thế giới (The World Health Organization), hàng năm, bệnh sốt rét đã ảnh hưởng đến khoảng 500 triệu người trên trái đất. Nguyên nhân gây ra bệnh là do ký sinh trùng sốt rét. Ký sinh trùng sốt rét được truyền từ muỗi cái. Nó gây sốt, co cứng cơ, đổ mồ hôi, run và đã cướp đi 2 triệu sinh mạng mỗi năm, trong đó phần lớn là trẻ em Châu Phi dưới 5 tuổi. Trong khi các phương pháp thông thường để kiểm soát bệnh sốt rét đã không còn có hiệu quả như trước đây cho nên sự ra đời một biện pháp mới là rất cấp thiết .

Vào năm 2000, các nhà khoa học ở Học viện Hoàng gia London và Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu lần đầu tiên trên Thế giới đã thành công trong việc đưa một gen ngoại lai vào genome của muỗi Anopheles stephensi và đã tạo ra muỗi chuyển gen.

Thành tựu này có ý nghĩa rất lớn, giúp các nhà khoa học đi đến một bước gần hơn để tạo ra muỗi không truyền bệnh sốt rét. Nói cách khác, sự truyền căn bệnh quái ác này có thể được kiểm soát thông qua sự thao tác trên các gen của muỗi để phá vỡ sự tương tác qua lại giữa muỗi với ký sinh trùng sốt rét, bằng cách tạo ra một môi trường ở trong cơ thể muỗi mà có thể ngăn cản ký sinh trùng sốt rét sống ở đó. Cũng có thể thay đổi tập tính của muỗi làm cho nó thích hút máu động vật hơn máu người hoặc tạo ra muỗi bất dục đực một cách chọn lọc để làm giảm quần thể muỗi. Các nhà khoa học đều nhất trí về tiềm năng to lớn của sự phát triển này để chống lại bệnh sốt rét và cho rằng trong thời gian tới muỗi chuyển gen sẽ được tạo ra ổn định, an toàn và không có khả năng truyền bệnh sốt rét.

Các nhà nghiên cứu đã xen vào phôi A. stephensi gen mã hoá protein huỳnh quang màu xanh lá cây- GFP (green fluorescent protein) sử dụng một yếu tố vận động của Drosophila hydei. Gen mã hoá protein này được sử dụng bởi vì nó hoạt động như là một marker và GFP tạo thành có khả năng được nhìn thấy dễ dàng dưới tia UV để nhận biết muỗi đã được tích hợp thành công gen ngoại lai.

Sự biểu hiện GFP của ấu trùng vi tiêm là cao, chiếm gần 50% số ấu trùng sống sót sau khi vi tiêm. Tuy nhiên, đến giai đoạn trưởng thành thì chỉ còn khoảng 10%. Sự xâm nhập vào nhiễm sắc thể và sự di truyền của gen GFP cho thế hệ sau cũng được chứng minh một cách chi tiết.

Một vấn đề khó khăn gặp phải trong nghiên cứu này là các quả trứng muỗi vừa mới đẻ trở nên cứng rất nhanh làm cho việc vi tiêm gen vào là rất khó. Chỉ sau khi khám phá ra dung dịch p-nitrophenol p-guanidinobenzoate (pNpGB), một hợp chất làm chậm tốc độ cứng và không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi muỗi thì mới có thể tiến hành đưa gen ngoại lai và một cách tự nhiên. Muỗi cái được cho đẻ trứng trong dung dịch pNpGB, chất này sẽ ngăn cản enzyme phenoloxidase, bước đầu tiên trong quá trình melanin hoá.

Vào năm 2002, các nhà nghiên cứu thuộc trường Ðại học Case Western  Reserve (CWRU) ở Cleveland, Ohio, Mỹ đã phát triển một loại muỗi chuyển gen chống sốt rét ở chuột.

Chúng ta biết rằng có nhiều loại muỗi nhưng duy nhất chỉ có giống Anopheles truyền bệnh sốt rét ở động vật có vú. Muỗi là vật chủ bắt buộc đối với ký sinh trùng sốt rét kể từ khi nó không thể truyền trực tiếp từ người sang người. Khi muỗi hút máu một người bệnh, ký sinh trùng Plasmodium xâm nhập vào cơ thể và sinh sản ở ruột giữa của muỗi và tạo thành một dạng trung gian, dạng này xuyên qua vách ruột giữa đến khoang bụng và biến thành nang. Sau khoảng thời gian từ 10-15 ngày, các nang vỡ bung ra, hàng ngàn bào tử được giải phóng. Các bào tử này đi qua vách tuyến nước bọt và sẽ tồn tại ở tuyến này cho đến khi muỗi tiến hành chích người tiếp theo.

Với mục đích tìm ra gen có thể phá hoại quá trình này, nhóm nghiên cứu đã nuôi muỗi A. Stephensi bằng các hạt được phủ các sợi axit amin khác nhau và sau đó kiểm tra xem loại hạt nào dính với màng ruột của muỗi. Bằng cách chọn lọc và phối hợp các nhà khoa học đã tạo ra một hợp chất có khả năng dính rất cao gọi là SM1. Chất này có tác dụng làm giảm một cách có ý nghĩa số lượng ký sinh trùng xuyên qua vách ruột để biến thành nang.

Ðể việc sản xuất SM1 đúng lúc, người ta đã tìm ra gen mã hoá cho một loại enzyme tiêu hoá mà ruột muỗi tiết ra trong khi hút máu và nối nó với một gen được thiết kế để tổng hợp SM1. Sau đó cấu trúc này được đã được vi tiêm vào phôi muỗi A. Stephensi và nó đã tự tích hợp vào genome và trở thành một bộ phận của DNA muỗi. Protein SM1 sau khi được tổng hợp sẽ bám vào bề mặt biểu mô ruột, cạnh tranh với ấu trùng muỗi. Âúu trùng muỗi không có khả năng bám vào ruột sẽ chết. Bằng cách này SM1 đã ức chế khoảng 80% sự phát triển của ấu trùng. Tính trạng này đã được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Mặt khác, muỗi chuyển gen SM1 không bị ảnh hưởng đến sức sống kể cả tuổi thọ và sự sản xuất trứng.

Tuy nhiên các nhà khoa học cảnh báo rằng sự cần thiết phải tiến hành thử nghiệm nhiều hơn nữa để chứng minh phương pháp này là an toàn đối với người.

Trong việc tìm kiếm các gen kháng ký sinh trùng sốt rét, người ta cũng đã thành công khi chuyển gen phospholipase A2 (PLA2) của nọc độc ong vào muỗi A. Stephensi. Gen này được gắn với promoter carboxypeptidase của A. gambiae (AgCP). Kết quả phân tích bằng phương pháp Northern blot cho thấy mRNA của gen PLA2 được biểu hiện một cách đặc hiệu ở ruột của muỗi chuyển gen. Sự biểu hiện cao nhất ở thời điểm 4 tiếng sau khi hút máu. Phân tích Western blot và huỳnh quang miễn dịch đã phát hiện protein PLA2 ở biểu mô ruột giữa của rmuỗi chuyển gen khoảng 8-24 tiếng sau khi hút máu. Nhưng điều quan trọng là sự biểu hiện của gen chuyển đã làm giảm số lượng các nang, trung bình là 87% và làm giảm một cách đáng kể sự truyền ký sinh trùng sốt rét sang chuột. Kết quả này cho thấy gen PLA2 có thể được sử dụng để ngăn cản sự phát triển của ký sinh trùng sốt rét ở muỗi.              

Một hướng nghiên cứu khác đang được tiến hành là ngăn cản sự xâm nhập của ký sinh trùng vào tuyến nước bọt của muỗi. Sự ngăn cản ký sinh trùng xâm nhập vào các thời điểm khác nhau trong quá trình phát triển của nó là rất quan trọng bởi vì không có phương pháp nào là đạt hiệu quả 100% cả.

Các nhà nghiên cứu khác trước đây đã sử dụng một loại virus đã được sửa đổi tiêm vào muỗi để làm ngưng sự lan truyền ký sinh trùng. Nhưng phương pháp này có một số hạn chế là trong thực tế virus cũng có thể nhiễm vào người và virus không thể di truyền được từ thế hệ này sang thế hệ sau ở muỗi. Một khi muỗi chết thì sẽ chấm dứt khả năng của virus chống lại sốt rét.

Một thách thức mà các nhà nghiên cứu đang phải đối mặt đó là sự phát triển của các ký sinh trùng có khả năng kháng. Bởi vì áp lực của quá trình chọn lọc cao, khi một gen được đưa vào quần thể ký sinh trùng sốt rét thì sự phát triển của các dòng kháng có khả năng để xuất hiện. Nó tương tự như khi xử lý sự nhiễm khuẩn với kháng sinh, sau một thời gian vi khuẩn sẽ trở nên kháng thuốc.  Một vấn đề được đặt ra là sự sử dụng gen phức (multiple genes), trong đó mỗi một gen ngăn cản sự phát triển của ký sinh trùng một cách khác nhau là một phương pháp hiệu quả hơn.           

Sau khi tạo ra muỗi chuyển gen, chiến lược tiếp theo để khắc phục sốt rét là đưa dòng muỗi chuyển gen kháng ký sinh trùng sốt rét vào trong tự nhiên. Phương pháp này phải được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách cẩn thận để kiểm tra xem muỗi chuyển gen sống như thế nào khi được trộn chung với các quần thể muỗi không chuyển gen.

Kết quả nghiên cứu quần thể muỗi chuyển gen đầu tiên trong phòng thí nghiệm đã được các nhà khoa học thuộc Học viện Hoàng gia London công bố bố vào năm 2003.

Các nhà nghiên cứu đã chuyển gen marker huỳnh quang đỏ hoặc xanh vào 4 dòng muỗi A. stephensi. Ở các quần thể đối chứng bao gồm toàn muỗi chuyển gen, marker huỳnh quang đã duy trì một cách nguyên vẹn qua hơn 30 thế hệ. Nhưng khi muỗi chuyển gen được nhân giống với muỗi bình thường thì số lượng muỗi mang marker trong quần thể giảm mạnh và trong một số thí nghiệm gen marker biến mất hoàn toàn trong khoảng từ thế hệ thứ 4 đến thế hệ thứ 16. Giáo sư Charles Godfray-Giám đốc Trung tâm Hội đồng nghiên cứu môi trường tự nhiên về Sinh học Quần thể (NERC) của Hoàng gia đã thực hiện mô hình toán học về động lực học của quần thể muỗi. Nghiên cứu này cho phép khảo sát tỉ mỉ các quá trình khác mà có thể giải thích được sự hoạt động của muỗi chuyển gen trong quần thể hỗn hợp. Tác giả cho rằng, thông qua sự nhân giống của muỗi chuyển gen, gen chuyển có khả năng bị một hoặc nhiều đột biến có hại. Các đột biến có hại này không giết chết muỗi nhưng làm cho chúng thua thiệt trong sự cạnh tranh với muỗi bình thường. Vấn đề này có thể được hạn chế bằng cách sử dụng các chế độ lai làm giảm đến mức tối thiểu các ảnh hưởng của giống. Như vậy hoạt động của muỗi chuyển gen không ảnh hưởng lớn đến khả năng tồn tại của chúng.

Sự nghiên cứu các quần thể này quyết định hoàn toàn các quá trình điều chỉnh cũng như đánh giá sự an toàn và hậu quả môi trường của phương pháp mới này. Nó còn giúp đánh giá một cách toàn bộ tính khả thi của việc sử dụng muỗi chuyển gen để chống lại các bệnh tật như sốt rét, sốt vàng da, sốt xuất huyết và đóng vai trò là một bộ phận quan trọng trong các chiến lược phát triển trong tương lai để góp phần trục xuất các tai họa gây ra sự khổ sở cho nhân loại.

Vi tiêm DNA vào phôi giai đoạn sớm của muỗi gây sốt vàng da

Hiện nay nghiên cứu tạo cá chuyển gen ngày càng được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm. Khoảng 10 năm trở lại đây hàng loạt cá chuyển gen đã được tạo ra: cá hồi cầu vồng, cá hồi, cá rô phi, cá vàng, cá mú vằn, cá medaka, cá chép, cá nheo Mỹ, cá trê châu Phi, cá vền biển (seabream), cá hồi chấm hồng Bắc cực (Arctic charr). Những gen ngoại lai được sử dụng để biến nạp vào cá là gen hormone sinh trưởng (GH) người, gen GH bò, gen GH cá, gen δ-crystalline gà, gen ß-galactosidase vi khuẩn, gen kháng hygromycin, gen α-globin, gen protein chống lạnh ở cá, gen neomycin phosphotransferase (neo)... Ví dụ Mc. Envoy và cộng sự đã chuyển gen ß-galactosidae  vào cá hồi Ðại tây dương (Atlantic salmon), Ozato và cộng sự (1986) đã chuyển gen δ-crystalline gà vào cá medaka, Zhang và cộng sự (1989) đã chuyển gen GH cá hồi cầu vồng vào cá chép và cá trê. Trong cả ba trường hợp này gen ngoại lai đã được biểu hiện trong một số cá biến nạp.

Trong một số trường hợp, các sản phẩm sinh ra từ gen ngoại lai ở động vật chuyển gen có thể làm biến đổi kiểu hình của chúng. Ở cá chép chuyển gen GH cá hồi cầu vồng, polypeptid GH cá hồi cầu vồng đã được tìm thấy trong cá chép và do đó chúng lớn lên rất nhanh so với cá đối chứng. Những kết quả này cho thấy tiềm năng to lớn của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để đưa các gen quy định các tính trạng mong muốn vào một số loài cá quan trọng.

Có nhiều phương pháp khác nhau để chuyển gen cho động vật nói chung và cá nói riêng. Phương pháp có hiệu quả nhất là vi tiêm trực tiếp DNA vào phôi. Gần đây người ta cũng đã thử nghiệm thành công chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng trước khi cho thụ tinh. Muller F. và cộng sự (1992) lần đầu tiên công bố đã thành công trong việc sử dụng các tế bào tinh trùng đã xung điện để tạo cá chuyển gen. Phương pháp này được tiến hành bằng cách ủ tế bào tinh trùng cá trong dung dịch citrate loãng với DNA plasmid. Tiếp theo sử dụng xung điện có cường độ và điện trường cao để tăng lượng DNA xâm nhập vào tinh trùng. Tách chiết dịch mô và DNA genome của cá bột phát triển từ trứng thụ tinh với tinh trùng đã xử lý để kiểm tra hiệu quả của gen chuyển. Bằng phương pháp lai phân tử Dot blot và thử nghiệm sự biểu hiện của gen đã chứng minh sự có mặt và biểu hiện của gen ngoại lai trong 2,6 - 4,2% số cá bột của cá chép thường (Cyprinus carpio L.), cá trê Châu Phi (Clarias gariepinus) và cá rô phi (Oreochromis niloticus). Không có gen chuyển nào được tìm thấy trong cá bột thu được từ các thí nghiệm tương tự nhưng không xung điện tinh trùng.

Inoue (1992) đã chuyển gen vào phôi và cá bột thành công bằng phương pháp xung điện. Zuoyan Zhu (1993) cũng đã thành công trong việc chuyển gen ngoại lai vào cá bằng phương pháp biến nạp bằng xung điện: tổ hợp gen MThGH được chuyển vào trứng cá thụ tinh đã được loại bỏ màng chorion. Thông số biến nạp tối ưu là 250V / 22 µF / 20Ω / 1ms. Kết quả đạt được là khoảng 10% số trứng nở và phát triển cá thành cá chạch chuyển gen. Muller và cộng sự (1993) đã dùng gen luciferase đom đóm và lacZ của E. coli, cả hai gen này đều được gắn với promoter CMV-IE1, để chuyển vào trứng thụ tinh đã loại bỏ màng chorion của cá trê Châu Phi và cá mú vằn bằng phương pháp xung điện. Kết quả đạt được khoảng 25 - 50% phôi đã phát triển thành cá chuyển gen.

Anderson và cộng sự (1996) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá hồi cầu vồng (Oncorhynchus mykiss). Gen ngoại lai được sử dụng là gen luciferase đom đóm gắn với promoter CMV-IEP (cytomegalovirus immediate early promoter). Sự biểu hiện của gen được phát hiện trong các tế bào cơ dọc theo đường tiêm và các tế bào cơ phân tán trước vị trí tiêm. Tan và cộng sự (1997) đã chuyển gen chloramphenicol acetyltransferase (CAT) trực tiếp vào cơ vân cá mú vằn (zeabrafish) sử dụng plasmid pCMV-CAT1. Sự hoạt động biểu hiện của gen CAT đạt cực đại tương quan với lượng plasmid tiêm vào là 5 µg pCMV-CAT1. Sự hoạt động của gen CAT tăng lên một cách đều đặn qua 7 ngày đầu sau khi tiêm, với mức biểu hiện cao liên tục đến 1 năm. Gen CAT gắn với promoter virus cũng cho kết quả biểu hiện cao. Sự định vị hóa học mô sử dụng CMV  ß-gal cho thấy rằng chỉ các sợi cơ ở vị trí tiêm biểu hiện enzyme  ß-gal. Sự biểu hiện mạnh mẽ và liên tục của gen tiêm vào cho phép đưa ra giả thuyết có thể cá mú vằn là một hệ thống đơn giản và dễ bị ảnh hưởng đối với những nghiên cứu trực tiếp chuyển gen vào cơ. Zohrah Haji Sulaiman (1999) đã thành công trong việc chuyển gen trực tiếp vào cơ vân của cá mú (Seabass, Lates calcarifer) và tôm sú (Black Tiger Prawn, Penaeus monodon). Sự biểu hiện  của gen sau khi tiêm plasmid pCMV ß-gal được theo dõi đến 14 ngày sự biểu hiện của gen ß-gal được phát hiện đầu tiên ở cá sau khi tiêm 1 ngày và ở tôm là 2 ngày. Sự biểu hiện liên tục đến 7 ngày sau khi tiêm ở cá và 14 ngày sau khi tiêm ở tôm. Tỉ lệ mẫu dương tính đối với sự biểu hiện của gen ß-gal ở cá là 33,3% và ở tôm là 20%.

Cho đến nay, ở cá người ta đã và đang tập trung nghiên cứu theo những hướng cơ bản sau:

 Chuyển gen hormone sinh trưởng (GH = growth hormone) vào cá

Hormone sinh trưởng là một protein có trọng lượng phân tử thay đổi tùy theo loài, ở người là 21.500 Da. GH được tiết ra từ thùy trước tuyến yên của động vật có xương sống. Ở động vật có vú GH cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển. GH có 191 axit amin, cấu trúc phân tử có 2 cầu nối disunfua

Sự bài tiết GH do hormone của hypothalamus là hormone giải phóng hormone sinh trưởng (GRH = growth hormone releasing hormone), hormone ức chế hormone sinh trưởng (GIH = growth hormone inhibiting hormone) theo cơ chế điều hòa ngược.

Cá đã được xử lý thí nghiệm với hormone sinh trưởng hoặc tuyến yên chiết từ các nguồn khác nhau như bò, lợn, cá. Tất cả các thí nghiệm đều làm tăng tốc độ sinh trưởng của cá. Sự sinh tổng hợp hormone sinh trưởng tái tổ hợp của gà, bò và cá hồi cầu vồng cũng đã cho thấy chức năng sinh học của gen hormone sinh trưởng bằng sự tăng cường tốc độ sinh trưởng của cá. Thật là có lý khi mong đợi cá chuyển gen hormone sinh trưởng người sẽ có chức năng giống như hormone sinh trưởng của các loài khác.

Qui trình công nghệ tạo cá chuyển gen hormone sinh trưởng người có thể tóm tắt bằng sơ đồ hình dưới. 

Sự tăng cường tốc độ sinh trưởng đã được quan sát ở cá chép chuyển gen MThGH.

Cơ chế của sự tăng cường sinh trưởng trong cá chuyển gen đã được khám phá dựa vào chức năng của hormone sinh trưởng người trên cơ sở sự tăng trưởng bộ xương và sự kích thích tổng hợp protein. Một số cá chép chuyển gen này vì vậy đã tăng cường độ dày cơ lưng và tăng trưởng bề ngang cơ thể và chúng đã có hình thái khác thường một cách đột ngột. Bề ngang cơ thể cho tới chiều dài cơ thể là một trong những tính trạng phân loại phổ biến. Con số này ở cá chép là 35% - 47%, nhưng ở một vài cá chép chuyển gen lại tăng lên đến 51% - 53,3%.

Mặc dù Trung Quốc không phải là nước đi đầu của cuộc cách mạng Sinh học phân tử nhưng vào năm 1985, giáo sư Zuoyan Zhu đã làm ngạc nhiên các nhà nghiên cứu Mỹ và Châu Âu khi công bố rằng nhóm nghiên cứu của ông đã chuyển được gen hormone sinh trưởng người vào cá. Theo Zhu thì thế hệ F1 của cá đã được chuyển gen này lớn gấp hai lần so với cá đối chứng. Mặc dù Zhu và cộng sự không trình bày bằng chứng đối với việc hợp nhất và biểu hiện của gen GH ngoại lai đó nhưng người ta đã thấy rằng gen GH cá có thể chuyển vào trứng của một số loài cá và được hợp nhất với DNA genome của các loài cá này.

Sơ đồ qui trình tạo cá mang gen hormone sinh trưởng bằng vi tiêm

Cá trê Châu Phi (Channel catfish) chuyển gen hormone sinh trưởng

Cá chép (Common carp) chuyển gen hormone sinh trưởng

Cá hồi chuyển gen hormone sinh trưởng (phải) và cá hồi đối chứng (trái)

Những nghiên cứu tiếp theo đã sử dụng một số gen GH động vật có vú, gen GH cá và các cDNA của GH. Chẳng hạn Zhang và cộng sự (1988, 1990) đã sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn lặp lại đầu tận cùng (LTR = Long Terminal Repeat) của virus Rous sarcoma (RSV) ở chim và cDNA của GH cá hồi để vi tiêm vào phôi cá chép đang phát triển. Tách chiết DNA genome từ vây ngực cá vi tiêm và đem phân tích dot blot và Southern blot, sử dụng LTR của RSV và cDNA của GH cá hồi làm mẫu dò, người ta đã tìm thấy đoạn hợp nhất p RSV - LTR - GH - cDNA của cá hồi ổn định và đã biểu hiện ra polypetid GH cá hồi. Cá chuyển gen có kích thước trung bình lớn hơn 22% so với cá đối chứng. Mặt khác, một số cá thể được chọn một cách ngẫu nhiên từ thế hệ con lai của các cá đực chuyển gen với một cá cái không chuyển gen đã di truyền gen ngoại lai này. Chúng không những lớn nhanh hơn cá không chuyển gen trong cùng một lứa mà còn lớn nhanh hơn rất nhiều lần so với bố mẹ. Gần đây, Du và cộng sự (1992) đã công bố kết quả chuyển gen GH cá vào cá hồi Ðại tây dương. Du đã sử dụng promoter của gen protein chống lạnh của cá lon chạch lớn (ocean pout, Macrozoarces americanus) nối cới cDNA của GH cá hồi trắng (chinook salmon, Oncorhynchus tschawytscha) và kết quả là kích thước cá hồi Ðại tây dương chuyển gen một năm tuổi tăng lên từ 2 - 6 lần so với cá đối chứng.

Ở Phần Lan, tại Trường Ðại học Kuopio, các nhà khoa học đang nghiên cứu sản xuất cá hồi cầu vồng chuyển gen có tốc độ sinh trưởng cao, có khả năng chuyển hóa tốt các thành phần thức ăn, đặc biệt là các carbohydrate rẻ tiền. Molsa, Krasnov và Pitkanen (1992) đã sử dụng gen hormone sinh trưởng cá hồi Ðại tây dương (ASGHG = Atlantic Salmon Growth Hormone Gene) để chuyển vào cá hồi cầu vồng và bằng kỹ thuật PCR đã chứng minh được sự hợp nhất của gen này vào genome cá hồi cầu vồng. Tuy nhiên, gen ASGHG đã được chuyển vào các loài khác một cách rộng rãi trên thế giới nhưng không thật sự làm tăng đột ngột tốc độ sinh trưởng của các loài nhận. Các nhà nghiên cứu Kuopio tin tưởng rằng các gen này ảnh hưởng đến hiện tượng chuyển hóa, chúng có thể cải tiến hiện tượng chuyển hóa carbohydrate nên có thể sử dụng carbohydrate rẻ tiền hơn để làm thức ăn cho cá hoặc có thể tăng cường khả năng kháng bệnh. Các gen này sẽ có ý nghĩa nhiều hơn đối với các gen tăng cường sinh trưởng trong kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản. Hiện tại, các nhà nghiên cứu thấy rằng kỹ nghệ nuôi trồng thủy sản của Phần Lan sẽ phải đợi 5 - 10 năm trước khi có thể đánh giá được cá chuyển gen thương mại. Ðể chứng minh sự hợp nhất của gen chuyển vào nhiễm sắc thể của động vật nhận và sự hoạt động của gen này các nhà nghiên cứu Kuopio sử dụng cá zebra danios. Cá zebra danios nhỏ, là loại cá nuôi nhiệt đới, thành thục trong 3 - 4 tháng và có thể nhân giống nhanh trong bể nuôi. Trứng cá được chọn và vi tiêm gen dễ dàng. Có thể thu được cá con vi tiêm và kiểm tra hoạt động gen một cách nhanh chóng. Với kết quả thu được, người ta đã thừa nhận lợi ích của gen chuyển với một thời gian rất ngắn khi so sánh với thời gian cần thiết để thừa nhận nó trong sự phát triển chậm chạp của cá hồi sống trong môi trường nước lạnh

Pitkanen và cộng sự (1999) đã chuyển gen hormone sinh trưởng cá hồi vào cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvilinus alpinus L.). Các tổ h